王麗梅,郝艷秋,石麗宏

膽紅素腦病是游離膽紅素通過血腦屏障進入腦組織,導致神經(jīng)細胞中毒變性,出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)[1]。膽紅素腦病時,一些單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)代謝紊亂,產(chǎn)生肌張力改變及運動協(xié)調(diào)障礙等一系列臨床癥狀,是導致小兒腦性癱瘓的原因之一,可造成手足徐動型腦癱,視聽障礙、智力障礙等嚴重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。本研究通過監(jiān)測亞低溫治療不同時間窗內(nèi)膽紅素腦病仔兔腦基底節(jié)中DA、5-HT含量變化,探討局部亞低溫對膽紅素腦病的神經(jīng)治療及保護作用,為臨床新生兒膽紅素腦病亞低溫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用純系新西蘭仔兔112只,兔齡2～5 d,體重60～ 100 g,自然分娩,雌雄不拘,購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心。將仔兔隨機分為4組:常溫對照組(NC):肛溫=37℃,n=28;亞低溫對照組(HC):肛溫 =33.5℃,n=28;常溫膽紅素腦病組(NB):肛溫=37℃,n=28;亞低溫膽紅素腦病組(HB):肛溫=33.5℃,n=28。4組仔兔又隨機分為0、6 h 、12 h 、24 h 組,每組各 7 只 。

1.1.2 試劑與儀器 膽紅素(C33H36N4O6,分子量584.7):美國Sigma公司;DA、5-HT測試盒;二乙酸熒光素及國產(chǎn)分析純或化學純等。儀器有HDB-01貼敷式局部亞低溫腦保護儀:哈爾濱工業(yè)大學熱工教研室研制;SL24型針型點溫傳感器(?=1.15 mm);熒光分光光度計;高效液相色譜儀等。

1.2 方法

1.2.1 造模 向NB組和HB組仔兔腹腔注射膽紅素200 μ g/g,NC組和HC組腹腔注射生理鹽水1 ml。給藥后恒溫、恒濕、避光環(huán)境中配方乳哺育4 h。仔細觀察仔兔神經(jīng)行為變化。

1.2.2 亞低溫治療 HB和HC組于造模結束后立即應用HDB-01貼敷式局部亞低溫腦保護儀治療,降溫帽置于仔兔頭部,三維靶點降溫,設定制冷溫度為8℃,腦內(nèi)制冷溫度33.0℃[3],腦溫過低采用60 W白熾燈加熱,過高用冰袋降溫,亞低溫時間分別為0、6 h、12 h、24 h。停止降溫后自然復溫。觀察治療期間仔兔的一般狀態(tài)。

1.2.3 取材 于相應時間點將仔兔用10%水合氯醛0.2 ml/100 g腹腔注射麻醉,經(jīng)左心室插管入主動脈,生理鹽水200 ml灌注,4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2;4℃)100 ml灌注固定。仔兔斷頭,冰盤下取出腦組織,剝離腦膜及大血管,以冷生理鹽水沖洗數(shù)次,自腦組織矢狀縫切開,一側立即于-20℃凍存,用于測定腦基底節(jié)區(qū)DA、5-HT及膽紅素含量。

1.3 5 -H T、DA及膽紅素測定 腦基底節(jié)區(qū)組織勻漿,按試劑盒說明操作,采用熒光分光光度計在激發(fā)光波長365 nm、發(fā)射波長480 nm下測樣品熒光強度,測定5-HT含量,在波長310/370 nm下測DA含量。膽紅素采用重氮檢測法:10倍體積冰醋酸勻漿,1500 r/min離心5 min,取上清液,再加等體積丙酮混勻,抽提、離心取上清液。各管分別加入重氮試劑,5 min后于波長540 nm下讀取吸光度。

2 結果

2.1 神經(jīng)行為觀察 NC和HC組仔兔于麻醉蘇醒后活動正常,吸吮有力,無異常神經(jīng)行為活動,對外界刺激有靈敏的逃避反應。NB組仔兔造模結束后表現(xiàn)為興奮、躁動和易激惹;6 h后出現(xiàn)俯伏,運動減少,對刺激反應遲鈍,動作遲緩,平衡差,轉圈,翻滾;12 h出現(xiàn)角弓反張,顫動,抽搐,不能步行;24 h出現(xiàn)四肢不能活動;2例死亡。HB組在亞低溫治療后12 h出現(xiàn)俯伏,運動減少,對刺激反應遲鈍,動作遲緩,平衡差,轉圈,翻滾;24 h對刺激反應較前靈敏,運動增加;未出現(xiàn)角弓反張,顫動,抽搐及不能步行;無死亡。

2.2 DA及5-HT變化 NB和HB組仔兔腦基底節(jié)中DA及5-HT含量于造模結束后與NC及HC組比較均明顯降低(P＜0.01),兩組間相比無顯著性差異(P＞0.05)。HB組于治療6 h、12 h、24 h時DA及5-HT含量與NB組比較均明顯升高(P＜0.01),于24 h接近正常。見表 1、表2。

表1 不同時間仔兔腦基底節(jié)中DA含量(nmol/g)

2.3 膽紅素變化 NB及HB組仔兔腦基底節(jié)中膽紅素于造模結束后與NC及HC組比較均明顯增高(P＜0.01),兩組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。HB組經(jīng)亞低溫治療6 h、12 h、24 h后,膽紅素含量明顯降低(P＜0.01)。見表3。

NB組腦組織中膽紅素含量與DA含量高度負相關(r=-0.99,P＜0.01)。

表2 不同時間仔兔腦基底節(jié)中5-HT含量(nmol/g)

表3 不同時間仔兔腦基底節(jié)中膽紅素含量(μ g/g)

3 討論

近年來國內(nèi)外一些研究證明,單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝紊亂在膽紅素腦病神經(jīng)元損傷,尤其是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中起重要作用[4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化處于相對平衡狀態(tài),膽紅素的神經(jīng)毒性可以打破這種平衡狀態(tài)。

Grojeans等發(fā)現(xiàn),膽紅素腦病時,游離膽紅素使線粒體功能受損[5],細胞處于氧化應激狀態(tài),產(chǎn)生過多的氧自由基[6];氧自由基可隨腦血流進入基底核區(qū),對多巴胺及非多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用,在此基礎上激活小膠質(zhì)細胞、啟動炎癥反應,導致神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏,最終引起進行性神經(jīng)元變性死亡,造成多巴胺能神經(jīng)元受損死亡[7]。而在殘存的多巴胺能神經(jīng)元中,因代償作用使多巴胺的合成、代謝和更新的速率都加快,產(chǎn)生更多的氧自由基進一步加重氧化應激,增加多巴胺能神經(jīng)元的損傷。當黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性超過80%時,就會出現(xiàn)錐體外系的失調(diào),失去對運動的自控能力[4]。

另外,中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在著5-HT能神經(jīng)元。膽紅素腦病時,腦干中縫核5-HT神經(jīng)元變性、脫失,導致紋狀體中5-HT減少及5-HT-組織胺系統(tǒng)失衡,使組織胺興奮作用增強而產(chǎn)生臨床癥狀,也表現(xiàn)為錐體外系癥狀。

動物實驗證實,亞低溫在海馬、腦皮質(zhì)、基底節(jié)、丘腦等處具有明顯神經(jīng)細胞保護作用[3]。近年來大量動物實驗及臨床研究表明,缺氧缺血后6 h內(nèi)給予持續(xù)72 h的亞低溫治療,神經(jīng)保護作用顯著[8]。亞低溫治療有全身亞低溫及局部亞低溫,由于兒科尤其是新生兒涉及保溫,所以多選擇局部亞低溫。目前亞低溫治療新生兒疾病尚處于早期臨床研究階段。周文浩等對24例中重度窒息足月新生兒進行頭部亞低溫治療并對其安全性評價,證實亞低溫治療將體溫維持在34.5℃左右,不會加重窒息新生兒心、肝、腎及血液、代謝等功能損害。本研究采用貼敷式局部亞低溫治療儀,所有實驗動物均未出現(xiàn)硬腫、呼吸暫停等,動物吸吮能力及進奶量在各組間未見明顯的差別,各組仔兔體重降低也不明顯,從而也證明亞低溫治療的安全性。

文香淑等對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在膽紅素腦病動物體內(nèi)的含量變化進行研究,證明膽紅素腦病時,基底神經(jīng)核區(qū)DA、5-HT含量下降,海馬、腦干、皮層均有輕度降低,腦干區(qū)NE下降,海馬、皮層、基底核NE均有下降趨勢,但無統(tǒng)計學意義;基底核DA、5-HT含量與腦干NE含量呈線性正相關,基底節(jié)區(qū)DA含量與5-HT含量線性正相關,表明膽紅素神經(jīng)毒性可使基底節(jié)區(qū)DA、5-H T能神經(jīng)元與腦干NE能神經(jīng)元同時受到破壞,影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放與攝取[9]。與本研究結論相似。本研究結果還顯示,未經(jīng)治療的膽紅素腦病腦組織內(nèi)膽紅素逐漸升高,并與腦組織DA負相關;表現(xiàn)為膽紅素濃度依賴性和作用時間依賴性[10]。這也為神經(jīng)行為學變化所證實。

本研究顯示,貼敷式局部亞低溫可以減輕膽紅素對腦組織的神經(jīng)毒性,減輕腦組織尤其是基底神經(jīng)核區(qū)DA、5-H T能神經(jīng)元的損傷,對腦組織具有保護作用,并可改善仔兔的神經(jīng)行為異常。亞低溫時間越長,效果越好。

目前認為,亞低溫治療時間越早預后越好,一般主張在發(fā)病后6 h內(nèi)使用;使用亞低溫治療時間可根據(jù)病情維持2～5 d,一般主張不超過7 d。但國內(nèi)也有報道因病情嚴重可應用14 d[8]。

[1]左啟華.小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:568-569.

[2]陳舜年,賁曉明,李佩紅,等.膽紅素腦病動物模型制作與鑒定[J].新生兒科雜志,1997,2(4):166-168.

[3]王德生,王曄.亞低溫腦保護[J].黑龍江醫(yī)學,2004,28(2):81-88.

[4]T erland O,Almas B,Flatmark T,et al.One-electron oxidation of catecholamines generates free radicals with an in vitro toxicity correlating with their lifetime[J].Free Radic Biol Med,2006,41(8):1266-1271.

[5]Grojeans Koziel V.Bilirubin induced aptgosis via activation of NMDA receptors in developing rat neurons[J].Ex p Neurol,2000,166(2):334-341.

[6]Wu J,Dougherty JJ,Nichols RA.Dopamine recepter regulation of Ca2+levels individual isolated nerve terminals from rat striatum:comparison of presynaptic D1-like and D2-like receptors[J].J Neurochem,2006,98(2):481-494.

[7]Kabuto H,Tada M,Kohno M.Eugenol[2-methoxy-4-(2-propenyl)phenol]prevents 6-hy-Droxydopamine-induced dopamine depression and lipid peroxidation inductivtty in mouse striatum[J].Biol Pharm Bull,2007,30(3):423-427.

[8]封志純,朱德新,常平.亞低溫在小兒腦損傷治療中的應用[J].實用兒科臨床雜志,2003,18(8):589-590.

[9]文香淑,李曉捷,郭麗,等.膽紅素腦病仔兔腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的研究[J].中國康復,2001,16(1):1-3.

[10]姜敏,朱長連,程秀永,等.新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的亞低溫治療[J].實用兒科臨床雜志,2004,19(4):285-287.