袁僑英,司良毅,李學(xué)軍

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院老年科,重慶400038)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料 犬由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。大量質(zhì)粒抽提試劑盒購于 TaKaRa公司(Japan)。HGF ELISA檢測(cè)試劑盒購于中杉金橋公司。SOD及銅鋅-超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)活性測(cè)定試劑盒、H2O2測(cè)定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。FA 1104電子天平(精確到0.000 1 g)購于上海精密科學(xué)儀器公司。

1.2 HGF裸質(zhì)粒擴(kuò)增及抽提 pcDNA3.0-HGF質(zhì)粒含人全長(zhǎng)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)基因序列,將HGF質(zhì)粒用氯化鈣進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化,細(xì)菌轉(zhuǎn)化后挑單一菌落接種于含氨芐青霉素的5 m L LB液體培養(yǎng)基中,溫和振蕩搖菌(37℃、150 r/m in)12 h。收集菌液按照試劑盒說明書抽提質(zhì)粒,酶切電泳鑒定證實(shí)為所需質(zhì)粒無誤后行菌種的大量培養(yǎng)擴(kuò)增。大量抽提質(zhì)粒,純化去除污染和毒素;酶切鑒定證實(shí)為HGF質(zhì)粒后溶解在生理鹽水中備用,濃度為1.0 mg/m L。

1.3 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉后,取右側(cè)臥位于手術(shù)臺(tái)上,常規(guī)消毒鋪單,行氣管插管術(shù),連接小動(dòng)物呼吸機(jī)正壓通氣輔助呼吸,潮氣量25～30m L/100 g體質(zhì)量,呼吸頻率 16～ 20次/min,吸呼比 1∶1。取胸骨正中切口開胸暴露心臟,剪開心包懸吊做心包吊床,在左室前下壁分離左冠狀動(dòng)脈前降支第一對(duì)角支,用4-0無創(chuàng)縫合絲線結(jié)扎冠脈第一對(duì)角支以下0.5 cm處,造成左室前壁和心尖部缺血,結(jié)扎后觀察室壁顏色和ECG,若結(jié)扎區(qū)室壁變白,心電圖ST段弓背抬高即判定為結(jié)扎成功。假手術(shù)組動(dòng)物只穿線不結(jié)扎。

1.4 HGF基因注射過程 在建立犬AM I動(dòng)物模型后,隨機(jī)分為3組(n=5),分別為假手術(shù)組(S組)、M I組(M 組)、M I+HGF治療組(HGF組)。HGF組在M I區(qū)域(左室前下壁及心尖)分5點(diǎn)進(jìn)行心肌內(nèi)注射 HGF基因,每點(diǎn)注射200μL(共1 000μg基因);待心跳穩(wěn)定后,逐層縫合心包、胸壁,排氣關(guān)胸。4周后摘取心臟,送液氮保存。

1.5 心肌形態(tài)觀察 解剖心臟,肉眼大體觀察有無心肌撕裂、穿孔、血腫等,HE染色光鏡下觀察心肌病理形態(tài)及微細(xì)結(jié)構(gòu)的改變。

1.6 心臟質(zhì)量指數(shù)測(cè)定 洗凈心臟,沿室間溝切開左室(包括室間隔),右室,吸干水分,用FA 1104電子天平測(cè)量各部分質(zhì)量。公式:左室心臟質(zhì)量指數(shù)(LVWI)=左室心臟質(zhì)量/體質(zhì)量,右室心臟質(zhì)量指數(shù)(RVW I)=右室心臟質(zhì)量/體質(zhì)量。計(jì)算左、右室心臟質(zhì)量指數(shù)。

1.7 心肌SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量測(cè)定 用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清、心肌SOD及 CuZn-SOD活性;H2O2與鉬酸作用生成絡(luò)合物,以比色法測(cè)定血清H2O2含量。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)值采用±s表示。采用 SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件分析,兩組間行t檢驗(yàn),多組間用方差分析作q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒抽提結(jié)果 經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)增,抽提的 HGF質(zhì)粒DNA經(jīng)ApaⅠ酶切、電泳,得其酶切鑒定圖譜。經(jīng)ApaⅠ酶切后質(zhì)粒DNA線性化,顯示一條帶,其大小為7.6 kb(對(duì)照為M arker),均符合pcDNA 3.0-HGF的長(zhǎng)度,純化去除污染和毒素。

2.2 巨體病理觀察 術(shù)后4周LAD結(jié)扎部位以下,M I模型犬均見沿左室前降支走行的左室心肌呈灰白色,形狀不規(guī)則;除S組外,其他各組動(dòng)物均可見手術(shù)部位心包粘連。M I模型犬均形成透壁性心肌梗死,累及左室游離壁大部分,梗死區(qū)心肌為灰白色菲薄瘢痕組織代替,質(zhì)硬。S組心臟形態(tài)正常。

2.3 心肌HE染色光鏡下觀察 (1)M組:梗死區(qū)心肌細(xì)胞和間質(zhì)組織均發(fā)生凝固性壞死,伴有較廣泛肌溶解及心肌細(xì)胞空泡變性,壞死心肌細(xì)胞被嗜伊紅濃染的纖維組織替代,交界區(qū)心肌呈現(xiàn)液化性肌溶解表現(xiàn),心肌細(xì)胞壞死、消失;另有部分心肌細(xì)胞增生肥大,伴有大量炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)。(2)S組:心肌纖維結(jié)構(gòu)清楚,排列整齊,無心肌細(xì)胞和間質(zhì)組織壞死,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和大小血管增生。(3)HGF組:所有標(biāo)本均可見明顯梗死區(qū),交界區(qū)見心肌細(xì)胞肥大增生,纖維增生較明顯、排列紊亂,心肌間質(zhì)內(nèi)有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),非梗死區(qū)心肌細(xì)胞代償性肥大。

2.4 HGF對(duì)心室重塑的影響 M組與S組相比,LVW I、RVW I升高(P＜0.01),與 M 組相比,HGF組 LVW I、RVW I降低(P＜0.01)。見表1。

表1 HGF對(duì)左室重塑的影響(±s,n=5)

表1 HGF對(duì)左室重塑的影響(±s,n=5)

與S組比較,*:P＜0.01;與M 組比較,▲:P＜0.05。

指標(biāo) S組 M組 HGF組LVW(g) 70.20±6.7 84.80±8.6* 77.50±11.2▲RVW(g) 12.20±1.9 15.20±1.8* 14.20±1.7▲LVW I(g/kg) 4.92±0.62 7.72±1.18* 6.51±1.08▲RVW I(g/kg) 0.82±0.04 1.35±0.15* 1.28±0.18▲BW(kg) 14.70±3.2 11.50±2.9 11.90±3.3

表2 HGF對(duì)血清和心肌 SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量的影響(±s)

表2 HGF對(duì)血清和心肌 SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量的影響(±s)

與S組比較,#:P＜0.01;與M 組比較,*:P＜0.01。

指標(biāo) S組 M組 HGF組血清SOD(U/m L) 545±135 374±79# 415±97*血清CuZn-SOD(u/m L) 288±54 165±43# 205±56*心肌SOD(U/m L) 369±74 232±45# 293±70*心肌CuZn-SOD(u/m L) 256±478 127±38# 184±41*血清H2O2(mmol/L) 28.5±6.2 46.9±9.1# 32.7±7.2*

2.5 HGF對(duì)血清和心肌SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量的影響 M組心肌、血清SOD及CuZn-SOD活性降低(P＜0.01),血清 H2O2含量升高(P＜0.01);HGF組較 M 組心肌、血清SOD及CuZn-SOD活性升高(P＜0.01),H2O2含量下降(P＜0.01)。見表2。

3 討 論

氧自由基可以攻擊生物膜,引發(fā)脂質(zhì)過氧化,損傷內(nèi)皮細(xì)胞,參與動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心肌疾病的整個(gè)病理生理病程。O2-自由基的金屬酶有保護(hù)細(xì)胞膜及臟器不受自由基損傷的生理功能,保護(hù)細(xì)胞,對(duì)抗氧自由基的毒性、調(diào)節(jié)H2O2濃度。研究表明,SOD也具有抗炎活性,能夠改善心肌能量代謝,保護(hù)左室功能,可改善缺血時(shí)左室收縮及舒張功能。SOD活性降低是自由基損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞的重要因素。

心肌缺血時(shí)自由基生成增加,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明急性心肌缺血后15m in氧自由基即明顯增加,引發(fā)心肌產(chǎn)生補(bǔ)體與炎性反應(yīng)損傷心肌[4-5],使心肌舒縮功能下降,參與心力衰竭的形成、發(fā)展。近年研究發(fā)現(xiàn),HGF是一種多功能因子,對(duì)多種組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的生理調(diào)節(jié)功能,可以通過抗細(xì)胞凋亡,促進(jìn)組織細(xì)胞的發(fā)生、生存和再生,刺激新生血管生成,抗纖維化,減輕心肌缺血再灌注損傷等多種功能,發(fā)揮多種有益的心血管保護(hù)作用,對(duì)心肌缺血有治療作用[6-7]。

直接注射HGF蛋白能減少梗死面積和改善心臟功能,而阻斷內(nèi)源性HGF表達(dá),導(dǎo)致梗死面積擴(kuò)大,表明HGF對(duì)缺血性M I的治療效果是通過保護(hù)心肌細(xì)胞和促進(jìn)血管的形成實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HGF質(zhì)粒能夠在缺血心肌中很好的表達(dá),HGF改善心室重塑和心功能的同時(shí),血清H2O2含量降低,心肌及血清SOD活性升高,提示HGF改善心功能的機(jī)制還可能與其增強(qiáng)SOD活性、抑制氧化損傷相關(guān)。

總之,HGF提高血液及心肌局部SOD、CuZn-SOD活性,使O2-和 H2O2生成減少,抑制AM I后心肌氧化損傷,改善心室重塑和心功能。

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