陳蘭蘭,羅海吉,查龍應(yīng)

(南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系,廣州510515)

大豆除了含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)之外,還含有豐富的生物活性物質(zhì)[1],其中大豆皂甙(soyasaponin,SS)是由萜類同系物與糖縮合形成的一類化合物(五環(huán)三萜類糖甙),主要分為 A、B、E和DDM P類皂甙[2]。SS具有抗癌、抗突變以及抗氧化等作用,其中,SS的抗癌作用尤為引人關(guān)注。有研究表明,SS對肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、皮膚癌以及前列腺癌等都具有抑制作用[3-6]。近來研究表明,SS的抑癌效果因其結(jié)構(gòu)而異[5,7]。SS經(jīng)腸道細菌糖苷酶水解后產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物大豆皂醇(soyasapogeno l,SG),主要包括SG-A、SG-B和SG-E,SG的生理活性與SS不同[5]。本文主要研究大豆總皂甙(total soyasaponin,TS)、SG-A和SG-B對人肝癌細胞株H epG2細胞的增殖抑制作用,探討其抑癌效果的差異。

1 材料與方法

1.1 材料 TS購自華北制藥股份有限公司,純度為80%;人肝癌細胞株HepG2細胞株購自中科院上海生化細胞所;噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶購自美國Sigma公司;DM EM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco公司;EPICU Elite流式細胞儀購自美國Beckman-coulter公司;Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自北京創(chuàng)根勝泰科技有限公司;ELX-808酶標(biāo)分析儀購自美國Bio-Tek公司。

1.2 研究方法

1.2.1 SG制備 參考Gurfinkel等[8]方法,用甲醇溶解TS后,加入濃硫酸進行熱水解,經(jīng)Sep-Pak C18固相萃取柱進行分離制備SG-A和SG-B,純度分別為57.3%和 62.6%。

1.2.2 細胞增殖抑制實驗 HepG 2細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于25 cm2培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)和傳代,將處于對數(shù)生長期的細胞按1×104/m L密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板,每孔200μL,在 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng) 24 h,細胞貼壁后,加入不同濃度(10～400μg/m L)的SS(SG-A、SG-B和TS),同時設(shè)不加藥物的陰性對照和不接種細胞的空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h,每個濃度每個時間點設(shè)置 6個重復(fù)孔。在每個時間點結(jié)束時于每孔培養(yǎng)板中加入20μL MTT,孵育4 h后小心吸去上清液,每孔加入200μL DMSO后用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處吸光值(A),實驗重復(fù)3次。細胞增殖抑制率按以下公式計算:抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.2.3 細胞凋亡檢測 收集陰性對照組和400μg/m L SG-A、SG-B和 TS分別作用于24、48、72 h后的細胞,按 Annexin VFITC/PI雙染凋亡試劑盒說明用流式細胞儀(美國EPICU Elite Beckman-coulter)進行細胞凋亡檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,結(jié)果以±s表示,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,用SPSS11.5的 Probit程序計算細胞增殖半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié) 果

2.1 SS對HepG2細胞增殖的影響 不同結(jié)構(gòu)SS對HepG2細胞增殖抑制率呈現(xiàn)時間和濃度依賴性,隨時間的延長和濃度的增加,抑制細胞增殖的效果更明顯。SG-B和SG-A對細胞增殖的抑制效果較 TS明顯,見表 1。

表1 不同結(jié)構(gòu)SS對H epG 2細胞的增殖抑制率(±s,%)

表1 不同結(jié)構(gòu)SS對H epG 2細胞的增殖抑制率(±s,%)

同一時間同一濃度時,不同上標(biāo)字母(a,b,c)表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

濃度(μg/m L)24 h 48 h 72 h SG-A SG-B TS SG-A SG-B TS SG-A SG-B TS 10 5.3±0.6a 5.4±0.3a 4.0±0.2b 8.1±0.9 7.2±0.4 6.5±0.4 9.5±0.4a 8.3±0.5b 7.4±0.1c20 7.5±0.6a 8.8±0.6b 6.7±0.1a 10.5±0.7 11.2±1.1 10.1±0.4 12.3±0.3a11.7±0.6a 9.5±0.4b40 8.2±0.7a10.3±0.5b 7.6±0.4a 12.0±0.5a14.4±0.5b11.2±0.9a 14.0±0.7a17.0±0.5b13.2±0.6a80 10.7±0.1a12.5±0.7b 8.8±0.2c 14.9±0.3a17.3±0.4b14.1±0.8a 17.2±0.8a18.6±0.6b15.1±0.6c100 11.5±0.6a15.0±0.3b11.1±0.7a 16.4±0.6a20.0±0.6b15.9±0.2a 22.9±0.7a26.0±0.4b19.2±0.6c160 13.9±0.9a18.6±0.6b12.6±0.6a 19.6±0.6a24.4±0.3b17.4±0.4c 27.4±1.0a31.8±2.0b22.7±0.9c200 19.1±0.5a21.7±1.4a16.2±0.2b 24.2±0.4a27.7±0.9b19.7±0.4c 34.3±1.4a39.4±1.1b27.2±0.6c400 22.9±2.0a24.5±0.6a18.5±1.5b 30.2±1.5a30.7±0.6a21.4±0.3b 37.4±1.9a48.2±1.4b31.3±1.7c

表2 不同結(jié)構(gòu)SS致HepG2細胞凋亡率變化(±s,%)

表2 不同結(jié)構(gòu)SS致HepG2細胞凋亡率變化(±s,%)

同一時間同一濃度時,不同上標(biāo)字母(a,b,c)表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Annexin V+/PI-Annexin V+/PI+組別合計24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h對照組 7.4±2.1d 7.8±0.9c 5.7±2.0 1.1±0.4 9.4±2.6b 14.9±2.1c 8.5±1.8d 17.1±2.4d 20.5±0.4cSG-A 組 22.0±3.0b22.2±1.4a 7.2±2.4 1.6±0.7 15.9±2.0b 26.1±4.2b 23.6±3.4b 38.1±1.7b 33.2±2.2bSG-B組 30.6±2.2a17.4±0.8b 10.5±2.9 2.0±0.5 32.4±3.3a 51.6±3.3a 32.6±2.7a 49.7±2.8a 62.1±5.4aTS組 14.0±2.5c21.1±1.6a 6.4±2.6 1.5±0.4 12.7±0.4b 16.3±1.4c 15.4±2.7c 33.8±1.9c 22.8±1.5c

圖1 不同結(jié)構(gòu)SS對HepG 2細胞增殖的IC50

圖2 流式細胞術(shù)檢測不同結(jié)構(gòu)SS(400μg/m L)作用72 h后致HepG 2細胞凋亡結(jié)果

2.2 細胞增殖IC50不同結(jié)構(gòu)SS作用H epG 2細胞72 h后的IC50有明顯差異(圖1),SG-A和 SG-B的IC50低于 TS,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 SS對HepG2細胞凋亡的影響 SS作用H epG 2細胞后能檢測到明顯的細胞凋亡現(xiàn)象(表2)。處理24 h后,SG-A、SG-B和TS誘導(dǎo)的早期凋亡均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),3種不同結(jié)構(gòu)SS誘導(dǎo)早期凋亡的作用呈現(xiàn)差異(SG-B＞SG-A＞TS)。隨著作用時間的延長,以晚期凋亡(或壞死)為主(圖2)。

3 討 論

SS的抗癌活性已得到腫瘤細胞體外培養(yǎng)實驗[4-5]、動物實驗[9]以及人群流行病學(xué)實驗[9-10]的證實,但這些實驗多以TS提取物開展研究,關(guān)于SS結(jié)構(gòu)與抗癌活性關(guān)系的研究直到近幾年才有報道[2,5,7],其主要原因在于受不同結(jié)構(gòu)SS分離純化技術(shù)的制約[1]。本實驗研究了TS以及兩種形式的SG-A和SG-B對HepG 2細胞的增殖抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),3種形式的SS均能有效抑制 HepG 2細胞的增殖,呈濃度和時間依賴關(guān)系,進一步分析3種SS對H epG 2細胞增殖的 IC50發(fā)現(xiàn),SG-A[(0.98±0.17)mg/m L]和SG-B[(0.50±0.02)mg/m L]的IC50值顯著低于 TS的IC50值[(1.96±0.51)mg/m L],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),表明 SG-A和 SG-B抑制 HepG2細胞的活性要強于 TS。Zhang和 Popovich[5]報道,TS、SG-A和 SG-B作用 HepG2細胞72 h后的IC50值分別為(0.594±0.021)mg/m L、(0.052±0.011)mg/m L和(0.128±0.005)mg/m L。研究表明SG-A和SG-B抑制HepG 2細胞增殖的活性高于TS,但不同的是SG-A的活性高于SG-B,這可能與SG的提取方法以及其純度不一致有關(guān)[11]。全吉淑等[12]研究了 TS和SG(含28.2%的SG-A和41.9%的SG-B)對人結(jié)腸癌H T-29細胞增殖的抑制作用。結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),SG的抑癌活性高于TS。

細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及退化有密切的關(guān)系[13-14],也是許多植物、化學(xué)物質(zhì)抑癌活性的機制之一[15-16]。有研究表明,SS能夠誘導(dǎo)不同類型的腫瘤細胞凋亡[3-5]。本實驗用Annexin V-FITC/PI雙染凋亡法檢測發(fā)現(xiàn),TS、SG-A和SG-B均能誘導(dǎo)HepG 2細胞發(fā)生凋亡,作用24 h后主要發(fā)生早期凋亡(Annexin V+/PI-),且SG-B誘導(dǎo)細胞早期凋亡的活性顯著高于SG-A,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),后者則又顯著高于TS,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨著作用時間的延長,細胞主要以晚期凋亡或壞死(Annexin V+/PI+)為主。

本實驗結(jié)果表明,SG(SG-A和SG-B)抑制人肝癌細胞株H epG 2細胞增殖的活性高于TS,誘導(dǎo)細胞凋亡可能是其機制之一,且SG誘導(dǎo)細胞凋亡的活性同樣高于TS。同時,SG-A和SG-B誘導(dǎo)細胞凋亡的活性也有差異,其誘導(dǎo)細胞凋亡的信號通路調(diào)控機制有待于進一步研究。此外,SG為SS的腸道分解產(chǎn)物,而腸道微生物菌群是否會影響SS的分解代謝,并進而影響SS抗癌活性的效果尚需進一步研究。

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