蔣 莉,羅佐杰△,鄺曉聰,梁杏歡,秦映芬,盧德成

(廣西醫(yī)科大學(xué):1.第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科;2.病理生理學(xué)教研室;3.第一附屬醫(yī)院老年內(nèi)分泌科,南寧 530000)

腎上腺皮質(zhì)腺癌(ad renocortical carcinoma,ACC)是發(fā)病率較低的癌癥之一,發(fā)病率不到百萬(wàn)分之一[1]。因此,病例數(shù)量少,標(biāo)本獲取困難,成為ACC研究的難題。在研究癌癥的各種實(shí)驗(yàn)中,動(dòng)物模型成為有效的實(shí)驗(yàn)工具。目前,國(guó)內(nèi)外已有眾多學(xué)者建立了大量癌癥的動(dòng)物模型,但對(duì)于ACC來(lái)說(shuō),動(dòng)物模型的建立比較少見。本實(shí)驗(yàn)采用注射人腎上腺皮質(zhì)腺癌細(xì)胞株(SW-13)至裸鼠腋窩皮下的方法建立人ACC動(dòng)物模型,

旨在為ACC的研究提供有效的實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 BALB/c裸鼠5只,鼠齡4～6周,體質(zhì)量18～20 g,購(gòu)于上海斯萊克公司。在無(wú)特異性病原體(SPF)、恒溫(22～26℃)、恒濕(50%～60%)的空氣潔凈的飼養(yǎng)架內(nèi)飼養(yǎng)。籠具、墊料、飼料均經(jīng)高壓蒸汽滅菌,飲水為高壓滅菌的純凈水。

1.2 細(xì)胞株 SW-13購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù),在 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)方式為置于含10%胎牛血清的F12/DMEM培養(yǎng)液中,以0.25%胰蛋白酶和0.53 mmol/L EDTA混合液消化傳代。

1.3 方法

1.3.1 ACC皮下模型的建立 參照王亞林等[2]的建立方法,

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW-13細(xì)胞,用D-H anks液去除培養(yǎng)瓶中殘余培養(yǎng)基,以0.25%胰蛋白酶消化,鏡下觀察當(dāng)細(xì)胞變圓、細(xì)胞與培養(yǎng)瓶底脫落時(shí),用含10%胎牛血清的F12/DM EM培養(yǎng)基終止消化。800 r/min離心5 min,棄上清液,用含10%胎牛血清的F12/DM EM 培養(yǎng)基重懸,調(diào)整密度至 1×107/m L,用0.5 m L注射器注射至裸鼠兩側(cè)腋窩皮下,每側(cè)注射量為0.2 m L。

1.3.2 成瘤觀察及取材 接種SW-13細(xì)胞后,每天觀察裸鼠進(jìn)食和精神狀態(tài)。觀察腫瘤形成、生長(zhǎng)情況并記錄腫瘤直徑大小。9周后,將裸鼠用乙醚麻醉后處死,將腫瘤取材,以電子天平稱重并取部分腫瘤組織,置10%甲醛固定液中固定,石蠟包埋,做常規(guī)病理切片,行 HE染色。然后分別將心、肝、脾、肺、腎及股骨取材,置10%甲醛固定液體中固定。

2 結(jié) 果

2.1 成瘤率及腫瘤生長(zhǎng)情況 6周后5只裸鼠均在腋窩皮下肉眼可見腫瘤,成瘤率為100%。腫瘤直徑隨時(shí)間推移逐漸增大。第8～9周,瘤塊直徑可達(dá)2～3 cm,腫瘤質(zhì)硬,活動(dòng)度較差(圖1)。

2.2 腫瘤及各臟器肉眼所見 肉眼見腫瘤位于皮下,表面凹凸不平,呈結(jié)節(jié)狀,實(shí)質(zhì)性。腫瘤表面有出血灶。腫瘤邊界清楚,與周圍組織易剝離,但底部與腋窩軟組織聯(lián)系較緊密,較難剝離。外觀呈粉紅色,剖面成魚肉狀,中間部分大量壞死,呈灰白色(圖2)。各臟器肉眼觀察均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。

2.3 病理學(xué)檢查 HE染色后光鏡下(×400)觀察,腫瘤由大量癌細(xì)胞組成,癌細(xì)胞排列緊密,不規(guī)則,間質(zhì)少。癌細(xì)胞呈大小不均的圓形,異形性明顯,核呈圓形、橢圓形,大小不等,核分裂相多見?？梢姴±砗朔至严?染色質(zhì)較粗,深染,核仁多見(圖3)。

圖1 裸鼠雙側(cè)腋窩皮下SW-13移植瘤(箭頭所示)

圖2 皮下移植瘤肉眼所見

圖3 皮下移植瘤HE染色結(jié)果(×400)

3 討 論

難以獲取臨床標(biāo)本給ACC的研究帶來(lái)了一定的困難,但是借助動(dòng)物模型可以有效解決部分難題。對(duì)于理想的ACC動(dòng)物模型,是能夠在宿主體內(nèi)模擬人ACC的發(fā)生、發(fā)展等各種生物學(xué)特性,并且重復(fù)性好,具備標(biāo)準(zhǔn)化。因此,原位移植成為備受推崇的動(dòng)物模型建立方法[3]。但是ACC很難實(shí)現(xiàn)的原因:(1)腎上腺是重要的內(nèi)分泌器官,微小的影響即可對(duì)整個(gè)機(jī)體造成嚴(yán)重的影響;(2)裸鼠的腎上腺體積過小,模型建立很難實(shí)現(xiàn)。這兩者決定了將癌細(xì)胞注射至腎上腺構(gòu)建移植瘤動(dòng)物模型的方法不可行。因此,只有采用其他的方法,使構(gòu)建的動(dòng)物模型盡可能接近理想模型。與其他的移植瘤模型相比,皮下移植瘤模型接種更為方便,容易在實(shí)驗(yàn)過程中觀察腫瘤生長(zhǎng)情況[4]。因此,選擇皮下移植不失為一種可行的辦法。

本實(shí)驗(yàn)采用 SW-13細(xì)胞株,此細(xì)胞系由Leibovitz等[5]建立,是一株非常穩(wěn)定的細(xì)胞系。將此細(xì)胞系注射于裸鼠雙側(cè)腋窩皮下后,腫瘤形成時(shí)間較一致,經(jīng)過6周左右的潛伏期成瘤,成瘤率達(dá)100%,提示SW-13細(xì)胞侵襲能力相當(dāng)高。因此,此方法可以為ACC的研究提供有效的實(shí)驗(yàn)工具[6-7]。然而,在臨床上 ACC常見的轉(zhuǎn)移部位是腹膜、肺、肝、骨,但是,本次建模后均未在各臟器發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶,提示裸鼠皮下注射的方法較難建立轉(zhuǎn)移模型,而在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中均未見到建立ACC轉(zhuǎn)移模型的相關(guān)報(bào)道。ACC轉(zhuǎn)移模型的建立仍然是一個(gè)難題,尚需進(jìn)一步研究。

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[3]周琪,梁后杰,閻曉初,等.人結(jié)腸癌裸鼠原位移植瘤模型的建立[J].重慶醫(yī)學(xué),2007,36(19):1929.

[4]盛書娟,花亞偉,張占東,等.人胃腸間質(zhì)瘤裸鼠移植瘤模型的建立[J].醫(yī)藥論壇雜志,2009,30(10):16.

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