楊春華，張毅方，石彥國，章振東

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，哈爾濱150076； 2.哈高科大豆食品有限責任公司，哈爾濱150078）

大豆蛋白因其具有較高的營養(yǎng)價值及改善質構的能力，而在食品加工中應用廣泛。通常，大豆蛋白由90%的球蛋白質組成，主要成分為11S及7S，分別占大豆蛋白的40%及27%。11S是一種分子量大約為35kDa的大豆球蛋白，由6個亞基組成，其酸性亞基及堿性亞基由二硫鍵連接；7S是由三個亞基通過非共價鍵組成的三聚鏈。7S具有較好的溶解性和乳化性，11S具有較好的凝膠性，但其分散性不好，而分散性的強弱直接影響了大豆蛋白在食品加工中的應用。因此，本文試圖對大豆分離蛋白進行改性進而提高其分散性。

蛋白質改性是人為地對蛋白質結構進行修飾，從而改善產品的功能性，目前常用的蛋白改性方法主要有化學法、酶法等等。其中，化學方法改性的副產物非常復雜、不易去除且反應不易控制。而酶法改性正好彌補了這方面的缺陷。實踐表明，酶改性是改善大豆蛋白功能特性的一個有效手段。中性蛋白酶Protex7L是一種從非基因改良的淀粉芽孢桿菌受控發(fā)酵提取的細菌中性蛋白酶制劑，該酶能夠在中性條件下水解較寬范圍的底物，它特別適合應用于不能改變pH的蛋白質水解反應中。本文以大豆分離蛋白為原料，采用中性蛋白酶Protex 7L對其進行酶解，試圖揭示酶解條件對大豆蛋白功能特性的影響，探索出一條適合于工業(yè)化生產的專用型大豆分離蛋白加工工藝。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

大豆分離蛋白：黑龍江哈高科大豆食品有限責任公司；

Protex7L中性蛋白酶：無錫杰能科試劑公司；

NaOH：分析純，天津市大陸化學試劑廠。

1.2 主要儀器

DZKW-4電熱恒溫水浴鍋：黃驛市渤海電器廠；

PB-20pH計：德國SARTORIUS；

2300 KAU蛋白儀：瑞典FOSS；

分離機：BECKMEN；

BSZ10S電子天平：德國SARTORIUS；

HZQ-C空氣振蕩器：哈爾濱市東聯電子技術開發(fā)有限公司；

CJJ-781型磁力攪拌器：金壇市望華科教儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆蛋白中蛋白質含量測定 凱氏定氮法（GB/T5009.5-2003）。

1.3.2 水解度（DH值）測定方法 采用pH-stat法。

B：消耗堿量；

N：NaOH摩爾濃度；

α：大豆蛋白氨基的平均解離度，當pH值為7時，α=0.44；

m：水解液中蛋白質的總質量；

h：每克蛋白質底物具有的肽鍵毫摩爾數，對于大豆蛋白h=7.75。

1.3.3 分散性評價 本實驗采用蛋白質分散指數PDI(Protein Disperse Index)作為評價大豆分離蛋白分散性的指標。

1.3.4 Protex7L酶解大豆蛋白的試驗設計

1.3.4.1 加酶量對大豆分離蛋白酶解的影響 按底物濃度為12%，反應溫度為50℃，反應時間為1h，pH值為7.0，加酶量分別為3.364AU/g SPI、6.728AU/g SPI、13.456AU/g SPI、26.912AU/g SPI、53.824AU/gSPI，以水解度和分散性為指標，探討加酶量對酶解反應的影響。

1.3.4.2 底物濃度對大豆分離蛋白酶解的影響 按加酶量為13.456AU/g SPI，反應溫度為50℃，反應時間為1h，pH值為7.0，底物濃度為9%、10%、11%、12%、13%，以水解度和分散性為指標，探討底物濃度對酶解反應的影響。

1.3.4.3 反應溫度對大豆分離蛋白酶解的影響 按底物濃度為12%，反應時間為1h，pH值為7.0，加酶量為13.456AU/g SPI，反應溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，以水解度和分散性為指標，探討反應溫度對酶解反應的影響。

1.3.4.4 pH值對大豆分離蛋白酶解的影響 按底物濃度為12%，反應溫度分別50℃，反應時間為1h，加酶量為13.456AU/g SPI，pH值分別為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，以水解度和分散性為指標，探討pH值對酶解反應的影響。

2 結果及討論

2.1 加酶量對大豆蛋白酶解的影響

加酶量對大豆蛋白酶解程度的影響如圖1所示。

圖1 加酶量對大豆蛋白酶解程度的影響

從圖1可以看出，大豆蛋白酶解程度與加酶量呈正相關，但從水解度指標來看，隨著加酶量的增加，水解速率逐漸下降，DH值及PDI值上升速率趨緩。原因有二方面，一方面大豆蛋白的整個酶解過程是一個溶質的擴散過程，圖中過程開始時，曲線較陡，擴散速度較快，表明顆粒表面的可溶性蛋白較易擴散到溶液中去，隨著反應進行，顆粒表面的可溶性蛋白消耗殆盡，此時主要的擴散方式是由顆粒內部的可溶性蛋白向外擴散，其速率遠小于表面擴散速率，反映在曲線上，曲線逐漸趨緩；另一方面，酶解過程也是一個水解肽鏈的過程，剛開始酶解過程，隨著肽鏈不斷水解，不斷暴露出新的氨基，羧基等親水基團，因此產物在水中的分散溶解性迅速增加，隨著時間的延長，蛋白酶可水解的肽鍵減少，即使增加酶量，酶解速率亦趨緩?？紤]到成本因素及酶解反應情況，選用加酶量為13.5AU/gSPI較為適宜。

2.2 底物濃度對酶解程度的影響

底物濃度對大豆蛋白酶解的影響實驗結果如圖2所示。

圖2 底物濃度對水解度的影響

由圖2可見，隨著底物濃度增加，水解度和分散性逐漸降低。這是由于底物濃度過高，溶液粘性增加，變成凝膠狀，體系流動性較差，不利于蛋白質的充分溶解和分散，降低了酶與底物的接觸機會；底物濃度不僅影響DH值和PDI值，而且直接決定了大豆蛋白的產量和生產成本，生產中應盡量提高底物濃度。綜合考慮，確定底物濃度為10%為適宜的底物濃度。

2.3 反應溫度對酶解反應的影響

結果如圖3所示。

圖3 反應溫度對水解度的影響

由圖3可見，溫度對水解度的影響非常顯著。當溫度從40℃升高到55℃時，水解度從1.13%陡然增加到1.71%；而當溫度繼續(xù)升高時，水解度卻隨之降低。這種影響是因為溫度升高可使酶促反應加快，但在較高的溫度時，酶失活速率也加快。大豆分離蛋白的分散性呈隨溫度先升高后降低的趨勢，在55℃時達到最高。這是因為蛋白質溶液通常表現為非牛頓流體性質，加熱能加劇蛋白質分子的運動，從而加劇蛋白質分子的擴散。蛋白質在溶解時必需破壞蛋白質之間的相互作用，而加熱可使蛋白質分子間和分子內的二硫鍵斷裂，亞基伸展，分散性提高；但另一方面，過高的反應溫度，反應速度并沒有繼續(xù)加快，反而下降。這是因為酶分子吸收了過多的能量，引起了維持酶分子結構次級鍵解體，導致酶蛋白變性，使得酶活力減弱。故確定最佳反應溫度為55℃。

2.4 pH值對大豆蛋白酶解反應的影響

結果如圖4所示。

圖4 pH值對水解度的影響

從圖4可見，pH值為7時水解度已接近最大值，繼續(xù)調高pH值，對水解度影響不大，但若超過一定值，可能引起蛋白酶失活。這是由于酶作為一種特殊的蛋白質分子，其催化反應的能力與環(huán)境pH值密切相關，環(huán)境pH值會影響酶分子的構象和酶分子及底物分子的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性和酶促反應速度，pH值過高或過低均對酶促反應不利。認為適宜pH值為7.0。

蛋白質的分散性與電荷頻率及疏水性有關,高電荷頻率、低疏水性可以有效提高 其分散性。蛋白酶解過程可以改變蛋白質的結構，并提高電荷頻率，同時也增加疏水性，但由于電荷頻率的影響遠大于疏水性的影響，因此總的效果是增加蛋白質的溶解性。由圖4可見，當pH值為7時，大豆分離蛋白的分散性最高，偏離7時，酶活受影響，分散性降低，故最佳pH值為7.0。

3 結論

單因素實驗結果表明：加酶量、底物濃度、反應溫度及體系的pH值等因素在Protex7L酶解大豆蛋白中影響顯著。Protex7L的最適酶解條件為加酶量13.456AU/g、反應溫度55℃、底物濃度為10%、pH值為7.0，酶解時間為1h。在此條件下，水解度為1.57%，蛋白質分散指數為91.8%，可明顯改善大豆蛋白質的分散性，從而拓展其在食品加工中的應用范圍。

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