趙宏榮 王立英

（成都永康制藥有限公司，四川 成都 611130）

HPLC法測(cè)定復(fù)方苦木消炎顆粒中脫水穿心蓮內(nèi)脂含量

趙宏榮 王立英

（成都永康制藥有限公司，四川 成都 611130）

目的：建立復(fù)方苦木消炎顆粒中脫水穿心蓮內(nèi)脂的含量測(cè)定方法。方法：采用HPLC法對(duì)處方中穿心蓮的有效成分穿心蓮內(nèi)脂和脫水穿心蓮內(nèi)脂進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：本品穿心蓮內(nèi)脂測(cè)定有強(qiáng)烈干擾；脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定線(xiàn)性范圍為0.041 5～0.207 5μg(r=0.999 8)，平均回收率為99.60%(RSD=0.69%，n=6)。結(jié)論：HPLC測(cè)定復(fù)方苦木消炎顆粒脫水穿心蓮內(nèi)脂含量方法準(zhǔn)確可行，重復(fù)性好，可有效地控制復(fù)方苦木消炎顆粒的質(zhì)量。

復(fù)方苦木消炎顆粒；穿心蓮內(nèi)脂；脫水穿心蓮內(nèi)脂；HPLC

復(fù)方苦木消炎顆粒由原衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑復(fù)方苦木消炎片改劑型制成，處方為穿心蓮和苦木，具有清熱解毒，燥濕止痢之功效，用于細(xì)菌性痢疾，急性腸炎及各種急性感染性疾患。由于兒童在急性胃腸感染病方面發(fā)病率較高，而顆粒劑型適于兒童及部分不宜吞咽患者。原復(fù)方苦木消炎片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)專(zhuān)屬的定量檢測(cè)方法，為了提高復(fù)方苦木消炎顆粒質(zhì)量的可控性，本實(shí)驗(yàn)研究建立了脫水穿心蓮內(nèi)酯的HPLC含量測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 儀器

Waters WAT01110高效液相色譜儀；進(jìn)樣器：25μL注射器（HAM ILTON）。超聲波清洗器：AS10200A型 250W 50KHz。

1.2 試劑試藥

流動(dòng)相用試劑：水（超純水）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；其他試劑皆為分析純。

1.3 材料

陰性對(duì)照品（取苦木267 g粉碎成粗粉，照流浸膏劑與浸膏劑項(xiàng)下的滲漉法，用65%乙醇浸漬36 h，滲漉流速4m L/m in，收集滲漉液為藥材總量的12倍，過(guò)濾，濾液回收乙醇，濃縮成相對(duì)密度為1.04/80℃的清膏；加入淀粉至總量為1 000 g，制顆粒，混合均勻）；穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，含量測(cè)定用，批號(hào)110797-200307）；脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，含量測(cè)定用，批號(hào)110854-200305）；復(fù)方苦木 消 炎 顆 粒 （本公司自制050501、050601、050602、050603）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 穿心蓮內(nèi)酯 本研究參考《中國(guó)藥典》2005年版一部中清火梔麥片[1]的含量測(cè)定方法，對(duì)其色譜條件進(jìn)行了摸索，選用色譜柱：C18柱（Dikma Technologies 5μm 150×4.6mm）；流速：1m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；柱溫：30℃。以甲醇 -水（55∶45）和乙腈 -0.1%氨溶液（35∶65）為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果陰性對(duì)照有強(qiáng)烈干擾。

2.1.2 脫水穿心蓮內(nèi)酯

2.1.2.1 色譜條件的建立 色譜柱：C18柱（Dikma Technologies 5μm 150×4.6mm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%氨溶液（35∶65）；流速：1m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30℃。

2.1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品10μg的溶液，即得。

2.1.2.3 供試品溶液的制備 取供試品研細(xì)，取約0.3 g，精密稱(chēng)定。置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50m L，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.1.2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 照2.1.2.3項(xiàng)下方法確定的供試品制備方法制備。

2.1.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1），從供試品色譜圖可以看出，脫水穿心蓮內(nèi)酯峰要與雜質(zhì)峰達(dá)到基線(xiàn)分離，色譜柱理論板數(shù)應(yīng)不低于2 000。脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定按（中國(guó)藥典2005年版一部附錄ⅥD）外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。陰性對(duì)照在脫水穿心蓮內(nèi)酯峰相同保留時(shí)間處，基本無(wú)干擾峰。

2.1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密稱(chēng)取脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110854-200305)約20 mg，用甲醇溶解定容為50 m L，作為貯備液（0.415 mg/m L），分別精取此貯備液，加甲醇稀釋配制成濃度為2.075、4.15、8.30、12.45、16.60、20.75 μg/m L 的溶液。分別精密吸取配制的對(duì)照品溶液各10μL注入液相色譜儀測(cè)定（表1）。以峰面積積分值對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=17 232x+41.759 R2=0.999 7（n=6），見(jiàn)圖 2。

表1 脫水穿心蓮內(nèi)酯線(xiàn)形關(guān)系

結(jié)果表明，進(jìn)樣量在0.020 75～0.207 5μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，故可以采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法進(jìn)行計(jì)算；且由于標(biāo)準(zhǔn)截距小，則可用單點(diǎn)校正法（不考慮截距）進(jìn)行計(jì)算。

2.1.2.7 進(jìn)樣精密度考察 分別精密吸取同一份對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD為1.72%，說(shuō)明儀器精密度良好，可滿(mǎn)足含量測(cè)定要求。因此在進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，可以采用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。

2.1.2.8 供試品溶液與對(duì)照品溶液穩(wěn)定性考察 按含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，將對(duì)照品溶液和供試品溶液室溫放置，分別于0，1，2，5，10 h測(cè)定供試品與對(duì)照品溶液的峰面積積分值，試驗(yàn)表明，對(duì)照品溶液在室溫條件下放置10小時(shí)，脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積積分值基本沒(méi)有改變（RSD=1.14%）；供試品溶液同樣條件放置10小時(shí)，脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積積分值基本沒(méi)有改變（RSD=0.87%），供試品與對(duì)照品溶液在測(cè)試條件下穩(wěn)定，能滿(mǎn)足含量測(cè)定要求。

2.1.2.9 重現(xiàn)性考察 取同一批樣品5份，分別按脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定方法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算脫水穿心蓮內(nèi)酯含量。結(jié)果脫水穿心蓮內(nèi)酯平均含量為0.357mg/g，RSD為1.12%。結(jié)果表明，本方法重現(xiàn)性良好，結(jié)果穩(wěn)定。

2.1.2.10 系統(tǒng)耐用性實(shí)驗(yàn) 對(duì)同一批次樣品分別用不同Dikma和天津琛航的色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，同一批次樣品使用不同廠牌的色譜柱進(jìn)行含量測(cè)定，其相對(duì)偏差為0.67%，能通過(guò)本系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，方法有效。

2.1.2.11 加樣回收試驗(yàn) 取供試品(0.357mg/g)約0.3g，精密稱(chēng)定，分6個(gè)水平加入脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，按脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，可見(jiàn)樣品加樣回收良好。

表2 脫水穿心蓮內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.2.12 供試品含量測(cè)定結(jié)果 取研制的3批中試產(chǎn)品，分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定數(shù)據(jù)（n=3）

通過(guò)對(duì)3個(gè)批次樣品含量的測(cè)定，平均含量為0.367mg/g。

3 討論

3.1 穿心蓮主要含有脫水穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯苷等二萜內(nèi)酯類(lèi)化合物。在含量測(cè)定研究中，對(duì)穿心蓮含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，選用穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，分別進(jìn)行試驗(yàn)。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由于苦木藥材成分復(fù)雜可能對(duì)穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定造成干擾，因此在供試品的處理和流動(dòng)相的選擇上再次進(jìn)行了試驗(yàn)，穿心蓮陰性對(duì)照在保留時(shí)間內(nèi)仍有強(qiáng)烈干擾；采用HPLC法對(duì)樣品中脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果方法較為簡(jiǎn)便，且重現(xiàn)性好。

3.2 在供試品溶液制備時(shí)，參照《中國(guó)藥典》2005年版一部中穿心蓮片[2]含量測(cè)定方法，在相同條件下，甲醇提取含量高于乙醇，回流提取與超聲處理含量相近；提取時(shí)間30分鐘優(yōu)于20分鐘，40分鐘與30分鐘差異不大。最終確定供試品溶液制備選用甲醇作提取溶劑，超聲處理30分鐘。

[1]中國(guó)藥典2005年版一部 [S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社.2005:612.

[2]中國(guó)藥典2005年版一部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社.2005:549-550.

趙宏榮，男，執(zhí)業(yè)藥師。研究方向：中藥新藥。E-mail：cdykzy@163.com