孫廓 張鍵 陳統(tǒng)一

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科,上海 200032)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種生物進化過程中出現(xiàn)的高度保守現(xiàn)象。1998年Fire證實Guo等[1]發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制同源基因表達的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染了微量內(nèi)源或外源雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)所致并將這一現(xiàn)象命名為RNAi[2]。2000年Zamore等[3]確定RNAi發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的基因治療研究提供了一種新的方法,通過RNAi抑制基因的表達已成為腫瘤研究及治療的新策略。

1 RNAi的作用機制及特點

RNAi引發(fā)基因沉默都要經(jīng)過兩個保守的生物學(xué)過程:①起始階段不同來源的dsRNA被 Dicer(dsRNA-specific endonuclease)切割產(chǎn)生 siRNA(small interfering RNA)片斷;②效應(yīng)階段Dicer與核酸內(nèi)、外切酶及siRNA等一起形成核糖核苷酸蛋白復(fù)合物(RNA inducingsilencingcomplex,RISC),在ATP供能的條件下RISC中的核酸內(nèi)切酶切斷特異序列mRNA,mRNA殘基隨后迅速地被降解,從而沉默目的基因產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。RNAi具有高效特異性、遺傳性、長度限制性與濃度、時間及ATP依賴性等幾個特點。

2 RNAi與腫瘤:治療性研究

現(xiàn)有的腫瘤治療方法有手術(shù)切除、放射治療和藥物化學(xué)治療,這些治療方法均不能特異性地殺傷及完全根除腫瘤,而且有較大的副作用。RNAi可使突變基因穩(wěn)定靜默,而不影響正?；虻谋磉_,且具有簡易性、特異性及高效性的特點,在腫瘤的研究及治療上有著無可比擬的優(yōu)勢,并取得一系列的成果。

2.1 RNAi與癌基因及抑癌基因 許多腫瘤的發(fā)生是由于染色體上某個基因突變,RNAi可以針對變異基因設(shè)計干擾片段,從而特異性抑制變異的mRNA表達。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)在大多數(shù)胃癌中過表達,并與胃癌的發(fā)病相關(guān),RNAi抑制人胃癌細胞中的OPN的表達,能有效抑制胃癌細胞的生長、遷移和侵襲[4]。研究表明腎癌細胞中檢測到OPN的表達,利用siRNA下調(diào)OPN的表達后伴有線粒體相關(guān)凋亡通路的激活以及MMP-2和uPA等侵襲相關(guān)蛋白的表達下調(diào),顯著增加腫瘤細胞的凋亡同時減少其侵襲能力[5]。

Ras家族基因點突變與細胞癌變有關(guān)。Zhao等[6]發(fā)現(xiàn)敲除肝癌細胞中N-ras的表達能誘導(dǎo)細胞停滯在G0/G1期,顯著抑制人肝癌細胞的生長。Shi等也在胰腺癌細胞株中應(yīng)用 RNAi雙重沉默Ras/MAPK和PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白K-ras和Akt2后,能有效的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,有望為腫瘤治療提供新的策略[7]。

2.2 RNAi與細胞凋亡抑制基因 在腫瘤的發(fā)病機制中凋亡受抑是腫瘤細胞惡性克隆增殖的基礎(chǔ)。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是一類結(jié)構(gòu)上相似的蛋白質(zhì),目前已發(fā)現(xiàn)了8種IAP:X染色體相關(guān)IAP(XIAP),細胞IAP(c-IAP1,c-IAP2)、神經(jīng)元 IAP、Survivin、Apollon、Livin、和IAP樣蛋白-2。IAPs主要通過抑制特定的胱門蛋白酶來抑制細胞凋亡,在多種人腫瘤中可以檢測到 IAPs病理性的過表達。研究[8]發(fā)現(xiàn) c-IAP1,c-IAP2在骨肉瘤中表達升高,并且利用RNAi敲除c-IAP1,c-IAP2后可抑制骨肉瘤的生長。研究[9]報道利用RNAi在人結(jié)腸癌中封閉XIAP的基因表達,可增強其對化療的敏感性,促進細胞凋亡并延緩腫瘤的生長。Ku等[10]轉(zhuǎn)染SurvivinsiRNA至膀胱癌T24細胞,腫瘤細胞停滯于G2/M期,明顯促進腫瘤細胞凋亡。另有研究[11]報道利用RNAi沉默Survivin的表達后,可以抑制腫瘤細胞增殖,減少動物模型中腫瘤成瘤率,延長動物生存期。

Bcl-2和Bcl-xl是Bcl-2抗凋亡蛋白家族的主要成員,作用是調(diào)控細胞生存和凋亡,在許多人腫瘤中呈現(xiàn)過表達。研究[12]報道靶向Bcl-2和Bcl-xl的siRNA能增強各種因素誘導(dǎo)的腫瘤的細胞凋亡,并能增強腫瘤細胞對放化療的敏感性。利用RNAi沉默凋亡抑制基因有望成為腫瘤基因治療的一種很有前景的治療模式。

2.3 RNAi與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因 腫瘤的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一個非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),在腫瘤的發(fā)生過程中,某些基因的改變可以導(dǎo)致信號傳導(dǎo)通路的改變。細胞周期蛋白(cyclin)D1作為細胞周期調(diào)節(jié)因子之一,其過表達是多種人原發(fā)性腫瘤的特征,對腫瘤的診斷和預(yù)后判定具有重要意義。Deharvengt等[13]在胰腺癌中利用靶向cyclin D1的shRNA降低cyclin D1蛋白水平,能減少腫瘤細胞體外生長和侵襲及體內(nèi)腫瘤血管形成。cyclin E是一類核蛋白,調(diào)控細胞從G0或G1期進入S期。Todd等[14]發(fā)現(xiàn)在70%的RB+/p16+卵巢腫瘤中cyclin E表達異常增高,利用siRNA抑制cyclin E的表達后,腫瘤細胞大量蓄積于G1期,從而認(rèn)為cyclin E是卵巢癌又一潛在的治療靶點。cyclin B1作為調(diào)節(jié)細胞有絲分裂的正性調(diào)節(jié)因子,在細胞增殖中起到重要作用。Crombez等[15]在鼠荷瘤模型中利用瘤內(nèi)注射cyclin B1-siRNA后,可以有效抑制腫瘤生長。

2.4 RNAi與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個主動過程,腫瘤細胞通過運動穿破宿主結(jié)締組織、血管、淋巴管壁,從而進入體液循環(huán),再次穿破結(jié)締組織、血管、淋巴管壁在靶器官定位形成轉(zhuǎn)移灶。Liu等[16]在前列腺癌中利用shRNA抑制OPN的表達后,發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9的表達同時下調(diào),導(dǎo)致前列腺癌細胞在體外的增殖、遷移及侵襲均受到抑制,同時抑制動物體內(nèi)腫瘤生長。

尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中降解細胞外基質(zhì)的重要成分之一,在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Salvi等[17]通過選取高表達uPA的肝癌細胞系,轉(zhuǎn)染 uPA-siRNA抑制uPA基因表達,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細胞的遷移能力、浸潤性和增殖力均下降,這有望成為新型的肝癌基因治療手段。Gondi等[18]同時阻斷uPA和uPA受體的表達,結(jié)果顯示細胞色素C從線粒體中釋放并伴有caspase-8的激活,提示凋亡的發(fā)生。這些研究為多樣化利用RNAi研究腫瘤和治療腫瘤提供了實驗依據(jù)。

Bmi-1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertion site 1)與許多人腫瘤的發(fā)生、增殖及侵襲性相關(guān),并被認(rèn)為是診斷腫瘤的一項重要指標(biāo)。研究[19]報道應(yīng)用RNAi抑制Bmi-1的表達可以顯著影響腫瘤細胞生長、侵襲,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

2.5 RNAi與腫瘤血管生成相關(guān)基因 實體腫瘤的生長和增殖依賴于腫瘤血管的生成,這一過程取決于血管生成因子和抑制因子的相互拮抗和平衡。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial grow th factor,VEGF)被認(rèn)為是最主要的血管生成因子,其高水平表達是多種腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的獨立指標(biāo)。VEGF能特異地促血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖,可以促進血管的生長和側(cè)支循環(huán)的建立。Kim等[20]根據(jù)VEGF的基因序列設(shè)計了特異性的siRNA,轉(zhuǎn)染人前列腺癌細胞后腫瘤組織的血管密度和腫瘤體積顯著下降。另有研究[21]表明抑制VEGF的表達后可以抑制新生血管形成,促進腫瘤細胞凋亡,減小腫瘤體積。

缺氧誘導(dǎo)因子1-α是主要存在于實體腫瘤組織中的缺氧反應(yīng)性因子,在維持細胞能量代謝、腫瘤血管形成和轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用。研究報道在宮頸癌、上皮卵巢癌、胰腺癌及肝癌等中利用RNAi抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達后,可以有效地下調(diào)MMP-2,減少VEGF產(chǎn)物生成和血管形成,抑制腫瘤生長,具有腫瘤綜合治療的潛能。

2.6 RNAi與腫瘤耐受放化療相關(guān)基因 惡性腫瘤化療失敗的主要原因是腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥(MDR)。目前越來越多的研究認(rèn)識到耐藥的機制包括轉(zhuǎn)運蛋白的表達、藥物排出增加及藥物誘導(dǎo)的凋亡逃避等[22]。轉(zhuǎn)運蛋白 ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)和P-gp是由MDR1基因編碼的膜蛋白超家族,具有廣泛的細胞功能,可調(diào)控藥物局部滲透,并激活宿主免疫系統(tǒng)等[23]。在不同的腫瘤模型體內(nèi)外轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)MDR1基因表達,從而抑制P-gp蛋白或ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達,可增加抗腫瘤藥物在細胞內(nèi)的蓄積,增加化療敏感性。MDR1-siRNAs有望成為治療MDR1依賴性多藥耐藥腫瘤的治療新方法。Sun等[24]報道用靶向癌基因Ras-shRNA與長春新堿聯(lián)合治療人肝癌細胞,結(jié)果表明下調(diào)Ras的表達可以消除長春新堿誘導(dǎo)的P-gp和MDR1過表達,更有效的抑制人肝細胞肝癌的生長。Mu等[25]對Bcl-XL的實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)靶向siRNA處理的前列腺癌耐藥細胞對順鉑更敏感。

放射治療導(dǎo)致細胞損傷的主要靶點是DNA,其中經(jīng)DNA雙鏈斷裂損傷最為重要。針對DNA雙鏈斷裂時信號修復(fù)蛋白ATM和PKC等亞單位設(shè)計siRNA是增強腫瘤放療敏感性的良好靶標(biāo)。Li等[26]應(yīng)用靶向ATM蛋白的siRNA可以減少該蛋白的表達,從而顯著加強對放療的敏感性。XIAP的過表達與人類腫瘤耐受放療有關(guān),Wang等[27]設(shè)計靶向 XIAP的質(zhì)粒 shRNA,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人喉癌Hep-2細胞株,下調(diào)XIAP基因表達后腫瘤細胞明顯停滯于G0/G1期,并導(dǎo)致喉癌細胞的放療敏感性明顯增強。所以靶向敏感基因的siRNA聯(lián)合放化療無疑給腫瘤耐受傳統(tǒng)治療的患者帶來了新的希望。

3 展 望

RNAi作為一種新興的沉默特異基因序列的方法,以其快速、可靠、操作簡單的特點吸引了廣大科學(xué)研究者的關(guān)注,為各種腫瘤的基因療法提供了新策略。然而,RNAi的臨床應(yīng)用還存在著諸多問題,如設(shè)計高度特異性的siRNA,非編碼區(qū)的RNA是否對RNAi敏感,如何將siRNA安全導(dǎo)入細胞并在細胞內(nèi)穩(wěn)定地表達,siRNA藥物的靶向傳遞系統(tǒng)及實際應(yīng)用的安全性等,這些問題有待于科研工作者進一步努力去解決。

1 Guo S,Kemphues KJ.Par-1,a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J].Cell,1995,81(4):611-620.

2 Fire A,Xu S,M ontg omery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

3 Zamore PD,T uschl T,Shaw PA,et al.RNAi:double-stranded RNA directs the A TP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell,2000,101(1):25-33.

4 丁凱麗,陳李華.RNA干擾作用的機制及在治療消化系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2008,15(2):212-214.

5 Zhang A,Liu Y,Shen Y,et al.Osteopontin silencing by small interfering RNA induces apoptosis and suppitsses invasion in human renal carcinoma Caki-1 cells[J].Med Oncol,2009,17:[Epub abead of print].

6 Zhao M,He HW,Sun HX,et al.Dual knockdown of N-ras and epiregulin synergistically suppressed the growth of human hepatoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,387(2):239-244.

7 Shi XH,Liang ZY,Ren XY,et al.Combined silencing of K-ras and Akt2 oncogenes achieves synergistic effects in inhibiting pancreatic cancer cell g rowth in vitro and in vivo[J].Cancer Gene T her,2009,16(3):227-236.

8 Ma O,Cai WW,Zender L,et al.MMP13,Birc2(cIAP1),and Birc3(cIAP2),amplified on chromosome 9,collaborate with p53 deficiency in mouse osteosarcoma progression[J].Cancer Res,2009,15;69(6):2559-2567.

9 Dai Y,Qiao L,Chan KW,et al.Adenovirus-mediated downregulation of X-linked inhibitor of apoptosis protein inhibits colon cancer[J].Mol Cancer T her,2009,8(9):2762-2770.

10 Ku JH,Seo SY,Kwak C,et al.Cy totoxicity and apoptosis by survivin small interfering RNA in bladder cancer cells[J].BJU Int,2010,1:[Epub ahead of print].

11 Yang CT,Li JM,Weng HH,et al.Adenovirus-mediated transfer of siRNA against survivin enbances the radiosensitivity of human non-small lung cancer cells[J].Cancer Gene Ther,2010,17(2):120-130.

12 Fan T,Jiang G,Suo Z,et al.Down-regulation of the apoptosisinducing factor or Bcl-2 inhibitor of transcription by RNA interference can alleviate TAp63gamma-induced apoptosis in esophageal squamous carcinoma EC9706 cells[J].Int J Oncol,2009,35(2):359-367.

13 Deharvengt SJ,Gunn JR,Pickett SB,et al.Intratumoral delivery of shRNA targeting cyclin D1 attenuates pancreatic cancer growth[J].Cancer Gene Ther,2009,23:[Epub ahead of print].

14 T odd MC,Spruill SC,M eerbrey KL.Small interference RNA-mediated suppression of overexpressed cyclin E protein restores G1/S regulation in NIH-OVCA R-3 ovarian cancer cells[J].Int J Oncol,2009,35(2):375-380.

15 Crombez L,Morris MC,Dufort S,et al.Targeting cyclin B1 through peptide-based delivery of siRNA prevents tumour growth[J].Nucleic Acids Res,2009,37(14):4559-4569.

16 Liu H,Chen A,Guo F,et al.A short-hairpin RNA targeting osteopontin downregulates MMP-2 and MM P-9 expressions in prostate cancer PC-3 cells[J].Cancer Letters,2010,5:[Epub ahead of print].

17 Salvi A,Bongarzone I,Miccieh F,et al.Pmteomie identification 0f LASP-1 downregulation after RNAi urokinase silencing in human hepatocelluar carcinoma cells[J].Neoplasia,2009,11(2):207-219.

18 Gondi CS,Kandhukufi N,Dinh DH.Dwonregulation of uPAR and uPA activates caspase-mediated apoptocis and inhibits the PI3K/AK T pathway[J].Int J Oncol,2007,31:19-27.

19 Jiang Y,Su B,Meng X,et al.Effect of siRNA-mediated silencing of Bmi-1 gene expression on HeLa cells[J].Cancer Sci,2010,101(2):379-386.

20 Kim WJ,Chang CW,Lee M,et al.Eficient siRNA delivery using water soluble lipopolymer for anti-angiogenic gene therapy[J].J Control Release,2007,118(3):357-363.

21 Yang Y,Bai Y,Xie G,et al.Efficient inhibition of non-smallcell lung cancer xenograft by systemic delivery of plasmid-encoding short-hairpin RNA targeting VEGF[J].Cancer Biother Radiopharm,2010,25(1):65-73.

22 Gillet JP,Gottesman MM.Mechanisms of multidrug resistance in cancer[J].M ethods Mol Biol,2010,596:47-76.

23 Gillet JP,Efferth T,Remacle J.Chemotherapy-induced resistance by A TP-binding cassette transporter genes[J].Biochim Biophys Acta,2007,1775(2):237-262.

24 Sun HX,He HW,Zhang SH,et al.Suppression of N-Ras by shRNA-expressing plasmid increases sensitivity of HepG2 cells to vincristine-induced growth inhibition[J].Cancer Gene T her,2009,16(9):693-702.

25 Mu P,Nagahara S,Makita N,et al.Systemic delivery of siRNA specific to tumor mediated by atelocollagen:Combined therapy using siRNA targeting Bcl-x L and cisplatin against prostate cancer[J].Int J Cancer,2009,125(12):2978-2990.

26 Li W,Jian W,Xiaoping X.Enhanced radiation-mediated cell killing of human cervical cancer cells by small interference RNA silencing of ataxia telangiectasia-mutated protein[J].Int J Gynecol Cancer,2006,16(4):1620-1630.

27 Wang R,Li B,Wang X,et al.Inhibiting XIAP expression by RNAi to inhibit proliferation and enhance radiosensitivity in laryngeal cancer cell line[J].Auris Nasus Larynx,2009,36(3):332-333.