楊 柳， 楊安民， 杜俊蓉*

(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院藥理學(xué)與生物制藥學(xué)系，四川成都610041;2.中國醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所藥理部，四川成都610052)

口腔通過嘴與外界相同，口腔內(nèi)部溫度恒定，濕度高，有許多狹窄的地方可形成厭氧環(huán)境，還有食物剩渣和老化壞死的細(xì)胞作為細(xì)菌的營養(yǎng)來源，是微生物生長的理想環(huán)境。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在宿主睡覺、談話、咀嚼和吞咽時，大約可有300－500種細(xì)菌進(jìn)入口腔并進(jìn)行繁殖生長?？谇恢械募?xì)菌、真菌等微生物大部分是有益菌，它們組成一個穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，這個生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性對口腔內(nèi)的衛(wèi)生非常重要。但若口腔衛(wèi)生條件不良、機(jī)體免疫力下降，菌群平衡失調(diào)，致病菌株過度繁殖則可能引發(fā)系列疾病?？谇怀Ｒ娂膊∪琮x齒、牙齦炎、牙周炎、牙齦膿腫、牙齒松動等都與口腔致病菌密切相關(guān)。甚至口腔中一旦出現(xiàn)微小傷口，致病菌還可隨著血液循環(huán)到達(dá)身體其他地方，引起關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎等疾病［1］。云南白藥是我國的傳統(tǒng)中藥，主要由三七、冰片、麝香等組成。其在民間用于治療外傷、出血、跌打損傷等已有超過百年的歷史，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究正不斷地挖掘著古老藥物的新藥理作用［2］。在我們的前期觀察中發(fā)現(xiàn)云南白藥對某些致病菌株有抑菌作用，故于本次試驗(yàn)中擴(kuò)大體外試驗(yàn)細(xì)菌譜及細(xì)菌株數(shù)，進(jìn)一步觀察云南白藥含漱劑的體外抑菌作用。

1 材料與試劑

1.1 藥物的制備和用法

云南白藥浸膏(批號20070201)及空白溶劑(批號20070201)，由云南白藥集團(tuán)股份有限公司提供。浸膏為深棕色黏稠液體，每克云南白藥浸膏相當(dāng)于生藥量2.82 g。空白溶劑為透明無色澄清液體，有特殊香氣。使用前先用無菌雙蒸水將空白溶劑1∶4稀釋，再用稀釋后的溶劑溶解稀釋浸膏至所需濃度藥物。

1.2 試驗(yàn)菌株

1.2.1 需氧菌包括:普通金黃色葡萄球菌(6株)、金黃色葡萄球菌甲氧西林耐藥菌(MRSA，10株)、金黃色葡萄球菌甲氧西林敏感菌(MSSA，14株)、表皮葡萄球菌甲氧西林耐藥菌(MRSE，11株)、表皮葡萄球甲氧西林敏感菌(MSSE，5株)、大腸埃希菌(7株)、肺炎克雷伯菌(8株)。

1.2.2 厭氧菌包括:變形鏈球菌(4株)、唾液鏈球菌(1株)、口腔鏈球菌(1株)、變黑普雷沃菌(1株)、中間普氏菌(1株)、脆弱擬桿菌(1株)、伴放線放線桿菌(2株)、具核酸桿菌(1株)、黏性放線菌(1株)、牙髓卟啉單胞菌(4株)、內(nèi)氏放線菌(1株)、棲牙普氏菌(1株)、衣氏放線菌(1株)。

1.2.3 真菌包括:白色念珠菌(10株)、熱帶念珠菌(2株)。

需氧菌菌株均為2005年10月至2007年5月于四川等地區(qū)三級甲等醫(yī)院的住院患者的各種體液標(biāo)本中分離的病原菌(由北京國家耐藥性檢測中心提供的四川地區(qū)臨床分離菌株及四川川北醫(yī)學(xué)院等單位提供)。厭氧菌菌株均為2007年5月由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院微生物教研室提供;真菌為2007年5月由中國國家臨床檢驗(yàn)中心提供。所有菌株在分離單位經(jīng)自動細(xì)菌鑒定儀(VTITEK2，VTITEK32)及Phoenix100藥敏分析系統(tǒng)(USA)鑒定，再經(jīng)本室用常規(guī)方法及API系統(tǒng)(法國梅里挨公司)重新鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 培養(yǎng)基

需氧菌選用MH培養(yǎng)基(Gelose Mueller Hinton 2)Biomerieux公司產(chǎn)品，批號:804895301;厭氧菌選用腦心浸液培養(yǎng)基(BRAIN HEART INFUSION AGAR)OXOID產(chǎn)品，批號:391764;真菌選用沙氏培養(yǎng)基，按蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂18 g，雙蒸水900 mL的比例配制，配制完畢后加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，定容至1 000 mL，調(diào)整pH值至5.6后分裝高壓滅菌后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)條件

葡萄球菌選用MH培養(yǎng)基，按比例加入2%NaCl，35～37℃孵育18～24 h;其它需氧菌選用MH培養(yǎng)基35℃孵育16～18 h;厭氧菌選用腦心浸液培養(yǎng)基，加入10%無菌脫纖維兔血，0.5%氯化血紅素，0.1%維生素K1制成強(qiáng)化布氏瓊脂，厭氧環(huán)境，35～37℃培養(yǎng)42～48 h;真菌選用沙氏培養(yǎng)基，28℃孵育24～48 h觀察記錄結(jié)果。

2.2 體外抗菌試驗(yàn)方法

2.2.1 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration MIC)測定:云南白藥浸膏等樣品對所試菌株MIC值的測定方法采取美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI，即原NCCLs)推薦的瓊脂二倍稀釋法，按抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing)測定各試驗(yàn)藥物對試驗(yàn)菌株的最低抑菌濃度(MIC)。受試樣品稀釋至所需最高濃度，保留2 mL藥液，于無菌平皿內(nèi)加入1 mL藥液，剩下的1 mL藥液中加入1 mL無菌雙蒸水進(jìn)行對倍稀釋，如此方法可將藥液進(jìn)行系列二倍稀釋。無菌平皿中再加入融化的50℃ MH培養(yǎng)基14 mL，混勻，待冷卻晾干后備用。用多點(diǎn)接種儀(Denley A400，England)接種細(xì)菌，需氧菌及真菌的接種菌量約為106CFU/mL，厭氧菌的接種菌量約為108CFU/mL，蓋上皿蓋。需氧菌置于35～37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～24 h，觀察記錄結(jié)果;厭氧菌置于5%CO2環(huán)境35～37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)42～48 h，觀察記錄結(jié)果;真菌置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h，觀察記錄結(jié)果。以平皿內(nèi)未見細(xì)菌生長的藥物最低濃度判為最低抑菌濃度(MIC值)。

2.2.2 最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)測定:經(jīng)體外抑菌試驗(yàn)得出藥物對各個菌株相應(yīng)MIC值后，將MIC值以上濃度的藥液與試驗(yàn)菌株用上述相同方法再次進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)后觀察，無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為最低殺菌濃度。

2.3 體外抗菌試驗(yàn)藥物濃度(mg/L)選擇

根據(jù)有關(guān)同類產(chǎn)品文獻(xiàn)報道，以及前期試驗(yàn)所提供的預(yù)試驗(yàn)有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，設(shè)定本次實(shí)驗(yàn)中云南白藥含漱劑對需氧菌的藥物濃度按二倍稀釋在 1 000、500、250、125、62.5(64)、31.25(32)、15.6(16)、7.8(8)、3.9(4)、2 mg/L 范圍內(nèi);對厭氧菌的藥物濃度按二倍稀釋在128、64、32……0.03、0.015、0.005 mg/L范圍內(nèi);對真菌的藥物濃度按二倍稀釋在16、8、4……0.06、0.03 mg/L范圍內(nèi)。溶劑對照組對以上菌株得試驗(yàn)濃度均為 1 000、500、250……7.8、3.9、2.0 mg/L。

3 結(jié)果

3.1 云南白藥含漱劑等受試藥物對所試驗(yàn)的需氧菌菌株的體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果見表1，對所試驗(yàn)的厭氧菌菌株的體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果見表2，對所試驗(yàn)的真菌菌株的體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表1 云南白藥含漱劑對需氧菌的體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果

表2 云南白藥含漱劑及溶劑對照對真菌的體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果

表3 云南白藥含漱劑及溶劑對照對厭氧菌的體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果

3.2 結(jié)果分析:在本實(shí)驗(yàn)室條件下，此次所試驗(yàn)的云南白藥含漱劑，對所試驗(yàn)的需氧菌、厭氧菌及真菌表現(xiàn)出了較好的體外抗菌活性。尤其對口腔的重要致病厭氧菌如牙齦卟啉單孢菌、伴放線放線桿菌等有良好的體外抗菌活性。對所試驗(yàn)的4株牙齦卟啉單孢菌 PgATCC35406、Pg381、Pg47A－1、Pg981的MIC分別為16、16、16、1 mg/L;對所試驗(yàn)的2株伴放線放線桿菌ATCC29523、ATCC29522的MIC值分別為16、0.5 mg/L。對其他口腔重要致病厭氧菌如變黑普雷沃氏菌、具核酸桿菌、脆弱擬桿菌、放線菌屬菌株、唾液鏈球菌等都有較好的體外抗菌活性，MIC值大多在16～32 mg/L。對口腔中的變形鏈球菌體外抗菌活性稍弱，MIC為128 mg/L。

云南白藥含漱劑對口腔中常見的需氧致病菌如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等都有較好的體外抗菌活性。除少數(shù)耐藥葡萄球菌以外，對金黃色葡萄球菌MSSA和MRSA的MIC值多在2～32 mg/L之間，對表皮葡萄球菌的MSSE和MRSE的MIC值多在16～32 mg/L之間;對普通金黃色葡萄球菌的MIC值多為32 mg/L;對大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的MIC值多在16～32 mg/L之間。

云南白藥含漱劑對口腔中常見的真菌致病菌白色念珠菌有良好的體外抗菌活性，MIC在1～8 mg/L，但對于熱帶念珠菌在所測試范圍內(nèi)未表現(xiàn)出體外抑菌活性。

空白溶劑對照對所試驗(yàn)的菌株也有一定的體外抑菌活性作用，MIC值一般在125～1 000 mg/L之間。

云南白藥含漱劑對所試驗(yàn)的口腔中常見致病菌除了良好的抑菌作用以外，對部分菌株也表現(xiàn)出了殺菌作用，其MBC值大多為MIC的2～4倍，提示云南白藥浸膏對這些菌株在MBC濃度下有殺菌作用。

4 討論

口腔是全身寄居微生物密度最高、種類最多的部位之一，口腔微生物包括細(xì)菌、真菌和病毒，其中細(xì)菌為最主要的類型，目前能分離到的細(xì)菌菌種多達(dá)300余種［3］，包括革蘭陽性球菌如鏈球菌屬、葡萄球菌和微球菌等;革蘭陰性球菌如韋永菌、奈瑟菌屬等;革蘭陽性桿菌如乳桿菌屬、放線菌屬等;革蘭陰性兼性厭氧桿菌如嗜血菌屬、放線桿菌屬、嗜碳酸噬纖維菌屬，埃氏腐蝕菌等，其他微生物還包括螺旋體屬，支原體，真菌，病毒，原蟲等。口腔的溫度、濕度、酸堿度、氧化還原電勢等均是細(xì)菌等微生物滋生的良好條件［4－5］。

口腔感染是人體慢性感染中最常見的一種，可表現(xiàn)為牙齦炎、牙周炎、尖周炎、牙髓炎、智齒冠周炎、齒齦膿腫、口炎、唾液腺感染、口腔潰瘍、口角炎等［6］。近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)口腔細(xì)菌與身體其他部位疾病的相關(guān)性。如口腔頜面部間隙感染、上下頜骨骨髓炎多為牙源性感染所引起［7］;人口腔內(nèi)菌斑、唾藏中可培養(yǎng)出與胃內(nèi)具有相同的形態(tài)、生化、免疫特性的幽門螺旋桿菌(Hp)［8］;口腔病灶的患者可引起心內(nèi)膜炎、心肌炎、心包膜炎、心絞痛、心傳導(dǎo)阻滯等［9］，有人統(tǒng)計(jì)50%的風(fēng)濕性心臟病患者同時患有牙周膿腫［10］;有些病灶牙可引起風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;甚至泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等全身器官或系統(tǒng)的疾?。?1］。

對于已有某些基礎(chǔ)疾病的患者來說，口腔的清潔情況與其疾病的發(fā)展、預(yù)后均有密切關(guān)系。國外對168名糖尿病患者研究發(fā)現(xiàn)，那些患有嚴(yán)重牙齦炎的人很難控制血糖含量［12］。白血病是臨床上常見的一種造血系統(tǒng)惡性腫瘤，在疾病發(fā)展過程中常伴有發(fā)熱、脫水等，使口腔唾液濃縮、變稠，口腔黏膜清潔作用喪失，自潔能力下降，細(xì)菌迅速繁殖并分解糖類，患者由于白細(xì)胞質(zhì)和量的改變及常伴有免疫功能低下，極易受到感染(據(jù)報道化療期間，口腔感染率在90%以上)，它不但影響患者正常的生理功能，也可導(dǎo)致全身感染，嚴(yán)重者危及生命。由于抗生素的長期使用可能會抑制口腔內(nèi)正常菌群而導(dǎo)致菌群失調(diào)，并進(jìn)而導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，以及抗生素的毒副作用、易產(chǎn)生耐藥性及防治疾病的局限性［13－14］。近年來，中藥在口腔感染以及牙周病的防治方面越來越受到重視。

云南白藥是我國優(yōu)秀的傳統(tǒng)藥物，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究正不斷發(fā)掘著古老藥物的藥理作用。本試驗(yàn)通過云南白藥含漱劑與口腔常見細(xì)菌及真菌的體外抗菌活性測定，發(fā)現(xiàn)云南白藥含漱劑對所試驗(yàn)的需氧菌(MIC值多在2～32 mg/L)、厭氧菌(MIC值多在16～32 mg/L)及部分真菌(白色念珠菌MIC在1～8 mg/L)表現(xiàn)出了較好的體外抗菌活性。云南白藥含漱劑對所試驗(yàn)的口腔中常見致病菌除了良好的抑菌作用以外，對部分菌株也表現(xiàn)出了殺菌作用，其MBC值大多為MIC的2－4倍，提示云南白藥浸膏對這些菌株在MBC濃度下有殺菌作用。

本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)云南白藥含漱劑尤其對口腔的重要致病厭氧菌菌如牙齦卟啉單孢菌(MIC值1～16 mg/L)、伴放線放線桿菌(MIC值0.5～16 mg/L)、具核酸桿菌(MIC值16 mg/L)等有良好的體外抗菌活性。牙齦卟啉單胞菌(Pg)是目前公認(rèn)的牙周致病菌，Pg是牙周病、尤其是慢性牙周炎病變區(qū)或活動部位最主要的優(yōu)勢菌，而健康齦溝內(nèi)很少［15］。伴放線放線桿菌(Aa)則公認(rèn)其與牙周炎，特別與侵襲性牙周炎關(guān)系密切。具核梭桿菌(Fn)是菌斑、牙周袋等口腔感染部位的優(yōu)勢菌，其檢出數(shù)量、頻率與牙周組織的炎癥、破壞程度之間存在著正相關(guān)關(guān)系［16］。云南白藥含漱劑對牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌、具核梭桿菌等常見牙周病可疑致病菌具有明顯的體外抑制作用，提示本受試品可能對牙周病有一定的防治作用，可考慮日?？谇磺鍧嵒虬籽』颊叩瓤谇蛔o(hù)理時使用。云南白藥含漱劑抑菌作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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