彭江龍 崔玉寶 王華民 周 鷹 牛莉娜 吳 潔

（海南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,?？?571101）

塵螨變應(yīng)原Der f1植物表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)①

彭江龍 崔玉寶②王華民 周 鷹②牛莉娜 吳 潔

（海南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,?？?571101）

目的:構(gòu)建塵螨變應(yīng)原Der f1植物表達(dá)載體并侵染煙草葉片表達(dá)。方法:從保存的含pET28a（+）-Der f1的甘油菌株中擴(kuò)增Der f1基因,并克隆到質(zhì)粒載體中,提取質(zhì)粒,進(jìn)行測序;以ClaⅠ、SalⅠ雙酶切,將Der f1基因克隆到馬鈴薯X病毒（PVX）載體中,構(gòu)建植物病毒表達(dá)載體;將PVX-Der f1轉(zhuǎn)化膿桿菌,挑取Kan、Tet抗性陽性的菌株侵染煙草葉片進(jìn)行蛋白表達(dá),采用SDS-PAGE和Western blot對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定和分析。結(jié)果:經(jīng)SDS-PAGE分析,有4株煙草葉片蛋白提取物在34Mr處有特異性蛋白條帶;經(jīng)Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證其變應(yīng)原,結(jié)果顯示,煙草葉片中獲得的重組蛋白在34Mr處與陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合,而與陰性血清并不發(fā)生結(jié)合。結(jié)論:成功構(gòu)建了植物病毒表達(dá)載體PVX-Der f1并獲得表達(dá),為塵螨變應(yīng)原Der f1的研究提供新思路。

塵螨;Der f1;馬鈴薯X病毒（PVX）;植物表達(dá)

塵螨是現(xiàn)代屋宇生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員,從屋塵中檢出的螨類多達(dá)100種以上,其中常見種類有屋塵螨、粉塵螨、熱帶無爪螨等,可引起過敏性哮喘、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎等Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病。法國Roche[1]估計(jì)約60%～100%的哮喘患者對(duì)塵螨過敏。國內(nèi)學(xué)者用粉塵螨浸液對(duì)哮喘患者進(jìn)行皮膚挑刺試驗(yàn),47%～92.11%的成人患者呈陽性反應(yīng),51.64%～78.85%患兒對(duì)塵螨過敏[2]。用粉塵螨浸液與哮喘患者血清進(jìn)行放射免疫吸附試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)約30余種成份具有與特異性IgE結(jié)合的能力,其第一組分Der f1被認(rèn)為是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病最重要的變應(yīng)原[3]。

目前,臨床采用的是塵螨粗提浸液進(jìn)行診斷和治療,該浸液成份復(fù)雜,不但難以標(biāo)準(zhǔn)化,而且易產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。塵螨變應(yīng)原主要存在于螨的排泄物和皮殼中,采用生物化學(xué)方法提純塵螨變應(yīng)原,耗時(shí)長,過程繁瑣,成本較高,且不能從根本上提高變應(yīng)原的純度、避免免疫治療中副反應(yīng)的發(fā)生[4]。近幾年來,植物體作為生產(chǎn)疫苗和藥用蛋白的生物反應(yīng)器日益受到重視,與傳統(tǒng)的細(xì)菌、酵母等表達(dá)體系相比,植物種植簡單,不需要昂貴的發(fā)酵設(shè)備,可進(jìn)行翻譯后加工,且對(duì)人、畜安全[5]。馬鈴薯X病毒（potato virus X,PVX）為單鏈正義RNA病毒,基因組長6.4 kb,能侵染多種植物且能高水平復(fù)制,無昆蟲傳播介體,被廣泛地用作載體表達(dá)外源基因[6]。本研究擬采用PVX為載體,將塵螨主要變應(yīng)原Der f1置于煙草葉片中表達(dá),進(jìn)行分離純化獲得重組變應(yīng)原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株、載體和煙草 pET28a（+）-Der f1為本課題組保存,根癌膿桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）LBA4404（Strr、Rifr）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。馬鈴薯X病毒載體（PVX）PGR107（Kanr）及膿桿菌GV3301+PLICSa（輔助質(zhì)粒,四環(huán)素抗性,Tetr）由英國Sainsbury實(shí)驗(yàn)室David Baulcombe惠贈(zèng)。本生煙草（N.benthamiana）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所種植,6周齡,每株含葉片7～8片,離根部最近的為第1片葉。

1.1.2 酶及主要試劑 ClaⅠ酶、SalⅠ酶、Prime STARTM HSDNA Polymerase、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0 、DNA Ligation Kit、pMD19-T simple 、E.coliCompetent Cells JM109均購自TaKaRa公司。PVDFmembrane 、Western blot膜封閉液 、CBB-R250 染色 液購自天根生化科技（北京）有限公司,BCIP/NBT由Roche公司生產(chǎn),羊抗人IgE抗體購自北京生物制品研究所。親和色譜填料鎳瓊脂糖凝膠FF購自北京卓冠科技有限公司產(chǎn)品。氨芐青霉素（Amp）和卡那青霉素（Kan）均為Sigma公司生產(chǎn),其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物 根據(jù)GenBank AB034946公布的序列設(shè)計(jì)引物,上游引物引入ClaⅠ酶切位點(diǎn),下游加入SalⅠ酶切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)簽,由寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物 F:5′-ATCGATATGAAATTCGTTTTGGCCATTG-3′,下游引物 R:5′-GTCGACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATGATTACAACAT ATGGATATT-3′。

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)增目的基因Der f1 以保存的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）-Der f1為模板,以F/R為引物,用Prime STARTM HSDNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94℃變性5分鐘后,98℃10秒,57℃10秒,72℃1分鐘,30個(gè)循環(huán),72℃延伸5分鐘。取5 μl PCR產(chǎn)物上樣電泳,觀察目的條帶。

1.2.2 產(chǎn)物回收并構(gòu)建克隆質(zhì)粒 回收上述PCR產(chǎn)物,并將回收產(chǎn)物與pMD19-T simple連接,轉(zhuǎn)化,置含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,提取重組質(zhì)粒pMD 19-T-Der f1,用ClaⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定pMD19-T-Der f1重組質(zhì)粒,將陽性質(zhì)粒送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 構(gòu)建植物表達(dá)載體PVX-Der f1 用ClaⅠ/SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD19-T-Der f1和PVX載體,用DNA Ligation Kit將其連接,熱轉(zhuǎn)化至JM 109感受態(tài)細(xì)胞,用含Kan、Tet抗生素的LB培養(yǎng)液搖菌并提取質(zhì)粒,ClaⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定,獲得PVX-Der f1表達(dá)載體。

1.2.4 將PVX-Der f1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至膿桿菌 吸取3μl重組載體質(zhì)粒（0.5μg/μl）與100μl膿桿菌感受態(tài)細(xì)胞于離心管中混勻,置冰上10分鐘,以電激法轉(zhuǎn)化至膿桿菌,涂板、挑菌、搖菌,并以PCR法進(jìn)行鑒定,獲得陽性菌。同時(shí),以PVX空載體作為對(duì)照。

1.2.5 陽性菌株侵染煙草葉片（注射滲透法） 以上述陽性菌株的LB培養(yǎng)液作為侵染液（至OD600值為1.0～1.5）,在侵染之前,靜置過夜;用2ml注射器,吸取適量的侵染液,除去針頭,在葉片的背面輕按注射器,在葉片正面輕壓葉片,使液體滲透入植株葉脈;注射完畢后,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),共侵染8株煙草。

1.2.6 煙草葉片總蛋白的提取及SDS-PAGE分析在陽性菌株侵染煙草葉片后的第11天,自頂葉起取每株煙草葉片約1克,分別加提取緩沖液2m l,冰浴中研成勻漿,5 000 r/min室溫下離心10分鐘;取上清液,加入等體積的上樣緩沖液,沸水浴中煮沸10分鐘;10 000 r/min離心10分鐘,將上清液移于另一離心管中,即為所需煙草葉片總蛋白的提取物,置4℃保存,備用。煙草葉片蛋白粗提物經(jīng)0.22μm膜過濾后,各取 20μl,加入 20μl 2×SDS sample buffer,95℃加熱10分鐘,取10μl（約0.1OD）樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,剩余樣品-80℃保存。

1.2.7 Der f1煙草葉片表達(dá)產(chǎn)物的分離純化及

Western blot鑒定 用鎳瓊脂糖凝膠親和層析分離帶

His標(biāo)簽的重組蛋白,即取上述各株煙草葉片蛋白粗提物用0.22μm膜過濾,手工上樣至預(yù)平衡的鎳瓊脂糖凝膠FF親和柱,分別用含 25、50、75、100、

125、150mmol/L咪唑洗脫液進(jìn)行階段洗脫,收集各階段洗脫峰,用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度。將上述產(chǎn)物進(jìn)行混合,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)移、封閉后,以哮喘患兒血清混和物為一抗,以生物素標(biāo)記的抗人IgE抗體為二抗,以BCIP/NBT顯色,用Western blot鑒定重組蛋白變應(yīng)原性。

2 結(jié)果

2.1 獲得目的基因Der f1 以pET28a（+）-Der f1為模板,以F/R為引物,PCR擴(kuò)增后,1.0%瓊脂糖凝膠電泳后見特異性條帶（圖1）,回收產(chǎn)物構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD19-T-Der f1,雙酶切進(jìn)行鑒定（圖2）。

2.2 植物表達(dá)載體PVX-Der f1的構(gòu)建和酶切鑒定將純化后的目的基因Der f1與PVX載體連接,構(gòu)建植物表達(dá)載體PVX-Der f1,并熱轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,搖菌提取質(zhì)粒,行瓊脂糖凝膠電泳,ClaⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定,有三個(gè)質(zhì)粒經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示出兩個(gè)條帶,與預(yù)期相符（圖3）,說明PVXDer f1構(gòu)建獲得成功。

圖1 目的基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of Der f1 by the nested-PCR

圖2 重組質(zhì)粒pMD19-T-Der f1雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzymeanalysis of the recombinant plasm ids pMD19-T-Der f1

圖3 植物表達(dá)載體PVX-Der f1雙酶切鑒定Fig.3 Determ ination of the exp ression p lasm ids PVX-Der f1 by restriction enzyme digestion

2.3 粉塵螨變應(yīng)原第1組分煙草葉片表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析 煙草葉片蛋白粗提物經(jīng)0.22μm膜過濾后,進(jìn)行SDS-PAGE分析,有4株煙草葉片蛋白提取物在34Mr處有特異性蛋白條帶,即第2、3、4和6株煙草,而第1、5、7、8株煙草葉片提取物中均未出現(xiàn)此條帶（圖4）。

2.4 粉塵螨變應(yīng)原第1組分煙草葉片表達(dá)產(chǎn)物的純化 將第2、3、4和6株煙草葉片蛋白提取物混合物用鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱分離純化,經(jīng)SDSPAGE 電泳分析顯示,用 25、50、75、100、125、150 mmol/L不同濃度的咪唑溶液均可洗脫獲得目的蛋白（圖5）。收集這幾個(gè)洗脫液,冷凍干燥后共獲得約2.26mg重組蛋白純品,濃度為16.33mg/g（重組蛋白/可溶性蛋白）。

圖4 粉塵螨變應(yīng)原第1組分煙草葉片表達(dá)產(chǎn)物的 SDSPAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE analysis of rDer f1 in the leaves of Nicotiana bentham iana

圖5 Der f1煙草葉片表達(dá)產(chǎn)物純化組分的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein rDer f1 in the leaves of Nicotiana bentham iana

圖6 Western blot鑒定Der f1煙草葉片表達(dá)產(chǎn)物變應(yīng)原性Fig.6 Western blotanalysis of rDer f1 expression in the leaves of Nicotiana bentham iana

2.5 Western blot鑒定重組蛋白變應(yīng)原性 將第2、3、4和6株煙草葉片重組蛋白的純化產(chǎn)物,用Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證其變應(yīng)原性,結(jié)果顯示,煙草葉片中獲得的重組蛋白在34Mr處與陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合,而與陰性血清并不發(fā)生結(jié)合,表明Der f1煙草葉片表達(dá)產(chǎn)物可與粉塵螨特異性IgE發(fā)生結(jié)合,見圖 6。

3 討論

近年來,利用植物病毒載體表達(dá)外源基因已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,隨著載體構(gòu)建策略的不斷完善,多種病毒將被用于構(gòu)建不同類型的載體,從而表達(dá)各種不同目的的外源基因,同時(shí)更多的醫(yī)用蛋白或疫苗將在植物中得以表達(dá)。馬鈴薯X病毒（Potato virus X,PVX）基因組是單股正鏈RNA,長度約為6.4 kb,5′端有 m7GpppG 帽結(jié)構(gòu),3′端有poly（A）尾,它包括5個(gè)ORF。ORF1編碼 165 kD RNA聚合酶,是RNA合成所必需的唯一的來源于病毒的蛋白質(zhì);ORF2-ORF4三個(gè)基因互相重疊,稱為三基因區(qū)段,分別編碼 25、12、8 kD蛋白,這些蛋白與病毒在細(xì)胞間的移動(dòng)有關(guān),稱為移動(dòng)蛋白;其中25 kD已被證明是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的抑制因子,打破寄主植物的防御反應(yīng),使病毒成功侵染[7]。ORF5編碼PVX的25 kD外殼蛋白亞基,除了包裝核酸外,還是病毒細(xì)胞間移動(dòng)所必需的,并且在復(fù)制調(diào)節(jié)上也起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)使用英國Sainsbury實(shí)驗(yàn)室David Baulcombe等提供的PVX載體PGR107,含CaMv35S啟動(dòng)子,Nos終止子,抗性篩選標(biāo)志為kanr。在PVX外殼蛋白（CP）啟動(dòng)子前再插入一個(gè)拷貝的CP啟動(dòng)子,用以啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。在兩個(gè)啟動(dòng)子之間,利用cla I和sal I酶切位點(diǎn)引入外源基因。我們從原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）-Der f1擴(kuò)增獲得塵螨主要變應(yīng)原Der f1基因,將其插入PVX載體中,酶切鑒定結(jié)果顯示已成功構(gòu)建PVX-Der f1。

植物病毒作為載體表達(dá)外源基因,具有瞬時(shí)表達(dá)的特點(diǎn),一般在病毒侵染后1～2周外源蛋白表達(dá)量積累到高峰。Zhou等[8]將人GM-CSF編碼基因插入PVX載體上,并侵染煙草葉片,結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于煙草頂端的嫩葉中可溶性蛋白含量高于底端的老葉片,且在侵染10天后,蛋白表達(dá)水平達(dá)到高峰。本研究以膿桿菌介導(dǎo)PVX-Der f1侵染8株煙草,侵染后第11天采集頂端葉片,SDS-PAGE顯示有4株煙草中含有Der f1的編碼蛋白。在引物設(shè)計(jì)和合成時(shí),我們將組氨酸標(biāo)記引入目的基因。采用鎳瓊脂糖凝膠親和層析分離純化后,SDS-PAGE分析表明不同濃度的咪唑溶液均可洗脫獲得目的蛋白,證實(shí)重組蛋白中為Der f1和組氨酸的融合產(chǎn)物。

用粉塵螨粗提浸液進(jìn)行皮膚挑刺試驗(yàn)、選擇哮喘患兒陽性血清為一抗,生物素化羊抗人IgE為二抗,Western blot分析表明該重組蛋白可與粉塵螨特異性IgE發(fā)生結(jié)合,因此Der f1煙草葉片表達(dá)產(chǎn)物具有較好的變應(yīng)原性。

1 Roche N,Chinet TC,BelouchiN Eetal.Dermatophagoidespteronyssinus and bioelectric properties of airway epithelium:role of cysteine proteases[J].Eur Respir J,2000;16（2）:309-315.

2 崔玉寶,何 珍,李朝品.居室環(huán)境中螨類的孳生與疾病[J].環(huán)境與健康雜志,2005;22（6）:500-502.

3 Thomas W R,Wendy-Anne Smith,Hales B J.Characterization and immunobiology of house dustmite allergens[J].IntArch Allergy Immunology,2002;129（1）:1-18.

4 ThomasW R,SmithW A,Hales B Jetal.The allergenic specificities of the house dustmite[J].Chang Gung Med J,2004;27（8）:563-569.

5 杜小春,何正權(quán),陳 磊etal.植物生物反應(yīng)器表達(dá)藥用蛋白研究新進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2008;27（9）:135-143.

6 牛顏冰,史正文,王德富etal.重組馬鈴薯X病毒注射番茄果實(shí)高效表達(dá)胸腺素α1[J].生物工程學(xué)報(bào),2009;25（4）:537-541.

7 Módena N A,Zelada AM,Conte Fetal.Phosphorylation of the TGBp1 movement protein of Potato virus X by a Nicotiana tabacum CK2-like activity[J].V irusRes,2008;137（1）:16-23.

8 Zhou F,WangM L,A lbertHHetal.Efficient transientexpression ofhuman GM-CSF protein in Nicotiana benthamianausing potatovirus X vector[J].ApplMicrobiol Biotechnol,2006;72（4）:756-762.

[收稿2009-10-15 修回2009-12-08]

（編輯 許四平）

Plant vector construction and expression of Der f1 allergen of Dermatophagoides pteronyssinu

PENGJiang-Long,CUIYu-Bao,WANGHua-Min,ZHOUYING,NIULi-Na,WUJie.DepartmentofMicrobiologyand Immunology,HainanMedicalCollege,Haikou571101,China

Objective:To construct the plantexpression vector of Der f1 allergen of Dermatophagoides pteronyssinu and expression in tobacco lamina.Methods:The Der f1 genewas amp lified from theglycerin bacterium which contained pET28a（+）-Der f1 plasmid,cloned into the pMD 19-T plasm id,and then sequenced.The Der f1 genewas digested by ClaⅠand SalⅠ ,and cloned into potato virus X（PVX）to constructp lant expression vector PVX-Der f1,and then was transformed agrobacterium tumefaciens.The positive onewas selected to infect tobacco lamina for expressing target protein.The protein was identified and analysed by SDS-PAGEand Western blot.Results:Digestion and sequence analysis confirmed that the plantexpression vectorwas correct,and the SDS-PAGE and Westernblot results showed that themolecularweightof the protein was about34Mrand itcould specific bindingwith positive serum.Conclusion:The plantexpression vector of Der f1 is successfully constructed and the recombinant p rotein is also produced.

Dermatophagoides pteronyssinu;Der f1;Potato virus X（PVX）;Plantexpression

R384.4

A

1000-484X（2010）03-0250-04

①本課題為國家自然科學(xué)基金（30860261）、海南省自然科學(xué)基金（807070）

②鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院衛(wèi)生技術(shù)研究所,鹽城224006

彭江龍（1972年-）,男,碩士,講師,主要從事病原生物學(xué)與變態(tài)反應(yīng)性疾病的研究,E-mail:37584476@163.com。