彭江龍 崔玉寶 王華民 周 鷹 牛莉娜 吳 潔

（海南醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室,?？?571101）

塵螨變應原Der f1植物表達載體的構建及表達①

彭江龍 崔玉寶②王華民 周 鷹②牛莉娜 吳 潔

（海南醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室,?？?571101）

目的:構建塵螨變應原Der f1植物表達載體并侵染煙草葉片表達。方法:從保存的含pET28a（+）-Der f1的甘油菌株中擴增Der f1基因,并克隆到質粒載體中,提取質粒,進行測序;以ClaⅠ、SalⅠ雙酶切,將Der f1基因克隆到馬鈴薯X病毒（PVX）載體中,構建植物病毒表達載體;將PVX-Der f1轉化膿桿菌,挑取Kan、Tet抗性陽性的菌株侵染煙草葉片進行蛋白表達,采用SDS-PAGE和Western blot對表達蛋白進行鑒定和分析。結果:經SDS-PAGE分析,有4株煙草葉片蛋白提取物在34Mr處有特異性蛋白條帶;經Western blot進一步驗證其變應原,結果顯示,煙草葉片中獲得的重組蛋白在34Mr處與陽性血清發(fā)生特異性結合,而與陰性血清并不發(fā)生結合。結論:成功構建了植物病毒表達載體PVX-Der f1并獲得表達,為塵螨變應原Der f1的研究提供新思路。

塵螨;Der f1;馬鈴薯X病毒（PVX）;植物表達

塵螨是現(xiàn)代屋宇生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員,從屋塵中檢出的螨類多達100種以上,其中常見種類有屋塵螨、粉塵螨、熱帶無爪螨等,可引起過敏性哮喘、特應性皮炎、過敏性鼻炎等Ⅰ型變態(tài)反應性疾病。法國Roche[1]估計約60%～100%的哮喘患者對塵螨過敏。國內學者用粉塵螨浸液對哮喘患者進行皮膚挑刺試驗,47%～92.11%的成人患者呈陽性反應,51.64%～78.85%患兒對塵螨過敏[2]。用粉塵螨浸液與哮喘患者血清進行放射免疫吸附試驗,發(fā)現(xiàn)約30余種成份具有與特異性IgE結合的能力,其第一組分Der f1被認為是引起變態(tài)反應性疾病最重要的變應原[3]。

目前,臨床采用的是塵螨粗提浸液進行診斷和治療,該浸液成份復雜,不但難以標準化,而且易產生嚴重的過敏反應。塵螨變應原主要存在于螨的排泄物和皮殼中,采用生物化學方法提純塵螨變應原,耗時長,過程繁瑣,成本較高,且不能從根本上提高變應原的純度、避免免疫治療中副反應的發(fā)生[4]。近幾年來,植物體作為生產疫苗和藥用蛋白的生物反應器日益受到重視,與傳統(tǒng)的細菌、酵母等表達體系相比,植物種植簡單,不需要昂貴的發(fā)酵設備,可進行翻譯后加工,且對人、畜安全[5]。馬鈴薯X病毒（potato virus X,PVX）為單鏈正義RNA病毒,基因組長6.4 kb,能侵染多種植物且能高水平復制,無昆蟲傳播介體,被廣泛地用作載體表達外源基因[6]。本研究擬采用PVX為載體,將塵螨主要變應原Der f1置于煙草葉片中表達,進行分離純化獲得重組變應原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株、載體和煙草 pET28a（+）-Der f1為本課題組保存,根癌膿桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）LBA4404（Strr、Rifr）由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所提供。馬鈴薯X病毒載體（PVX）PGR107（Kanr）及膿桿菌GV3301+PLICSa（輔助質粒,四環(huán)素抗性,Tetr）由英國Sainsbury實驗室David Baulcombe惠贈。本生煙草（N.benthamiana）由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所種植,6周齡,每株含葉片7～8片,離根部最近的為第1片葉。

1.1.2 酶及主要試劑 ClaⅠ酶、SalⅠ酶、Prime STARTM HSDNA Polymerase、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0 、DNA Ligation Kit、pMD19-T simple 、E.coliCompetent Cells JM109均購自TaKaRa公司。PVDFmembrane 、Western blot膜封閉液 、CBB-R250 染色 液購自天根生化科技（北京）有限公司,BCIP/NBT由Roche公司生產,羊抗人IgE抗體購自北京生物制品研究所。親和色譜填料鎳瓊脂糖凝膠FF購自北京卓冠科技有限公司產品。氨芐青霉素（Amp）和卡那青霉素（Kan）均為Sigma公司生產,其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 引物 根據GenBank AB034946公布的序列設計引物,上游引物引入ClaⅠ酶切位點,下游加入SalⅠ酶切位點和組氨酸標簽,由寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物 F:5′-ATCGATATGAAATTCGTTTTGGCCATTG-3′,下游引物 R:5′-GTCGACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATGATTACAACAT ATGGATATT-3′。

1.2 方法

1.2.1 擴增目的基因Der f1 以保存的原核表達質粒pET28a（+）-Der f1為模板,以F/R為引物,用Prime STARTM HSDNA Polymerase進行PCR擴增,反應條件為:94℃變性5分鐘后,98℃10秒,57℃10秒,72℃1分鐘,30個循環(huán),72℃延伸5分鐘。取5 μl PCR產物上樣電泳,觀察目的條帶。

1.2.2 產物回收并構建克隆質粒 回收上述PCR產物,并將回收產物與pMD19-T simple連接,轉化,置含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,提取重組質粒pMD 19-T-Der f1,用ClaⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定pMD19-T-Der f1重組質粒,將陽性質粒送寶生物工程（大連）有限公司進行測序。

1.2.3 構建植物表達載體PVX-Der f1 用ClaⅠ/SalⅠ雙酶切重組質粒pMD19-T-Der f1和PVX載體,用DNA Ligation Kit將其連接,熱轉化至JM 109感受態(tài)細胞,用含Kan、Tet抗生素的LB培養(yǎng)液搖菌并提取質粒,ClaⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定,獲得PVX-Der f1表達載體。

1.2.4 將PVX-Der f1表達載體轉化至膿桿菌 吸取3μl重組載體質粒（0.5μg/μl）與100μl膿桿菌感受態(tài)細胞于離心管中混勻,置冰上10分鐘,以電激法轉化至膿桿菌,涂板、挑菌、搖菌,并以PCR法進行鑒定,獲得陽性菌。同時,以PVX空載體作為對照。

1.2.5 陽性菌株侵染煙草葉片（注射滲透法） 以上述陽性菌株的LB培養(yǎng)液作為侵染液（至OD600值為1.0～1.5）,在侵染之前,靜置過夜;用2ml注射器,吸取適量的侵染液,除去針頭,在葉片的背面輕按注射器,在葉片正面輕壓葉片,使液體滲透入植株葉脈;注射完畢后,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),共侵染8株煙草。

1.2.6 煙草葉片總蛋白的提取及SDS-PAGE分析在陽性菌株侵染煙草葉片后的第11天,自頂葉起取每株煙草葉片約1克,分別加提取緩沖液2m l,冰浴中研成勻漿,5 000 r/min室溫下離心10分鐘;取上清液,加入等體積的上樣緩沖液,沸水浴中煮沸10分鐘;10 000 r/min離心10分鐘,將上清液移于另一離心管中,即為所需煙草葉片總蛋白的提取物,置4℃保存,備用。煙草葉片蛋白粗提物經0.22μm膜過濾后,各取 20μl,加入 20μl 2×SDS sample buffer,95℃加熱10分鐘,取10μl（約0.1OD）樣品進行SDS-PAGE電泳,剩余樣品-80℃保存。

1.2.7 Der f1煙草葉片表達產物的分離純化及

Western blot鑒定 用鎳瓊脂糖凝膠親和層析分離帶

His標簽的重組蛋白,即取上述各株煙草葉片蛋白粗提物用0.22μm膜過濾,手工上樣至預平衡的鎳瓊脂糖凝膠FF親和柱,分別用含 25、50、75、100、

125、150mmol/L咪唑洗脫液進行階段洗脫,收集各階段洗脫峰,用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度。將上述產物進行混合,進行SDS-PAGE電泳,電轉移、封閉后,以哮喘患兒血清混和物為一抗,以生物素標記的抗人IgE抗體為二抗,以BCIP/NBT顯色,用Western blot鑒定重組蛋白變應原性。

2 結果

2.1 獲得目的基因Der f1 以pET28a（+）-Der f1為模板,以F/R為引物,PCR擴增后,1.0%瓊脂糖凝膠電泳后見特異性條帶（圖1）,回收產物構建克隆質粒pMD19-T-Der f1,雙酶切進行鑒定（圖2）。

2.2 植物表達載體PVX-Der f1的構建和酶切鑒定將純化后的目的基因Der f1與PVX載體連接,構建植物表達載體PVX-Der f1,并熱轉化JM109感受態(tài)細胞,搖菌提取質粒,行瓊脂糖凝膠電泳,ClaⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定,有三個質粒經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示出兩個條帶,與預期相符（圖3）,說明PVXDer f1構建獲得成功。

圖1 目的基因擴增結果Fig.1 Amplification of Der f1 by the nested-PCR

圖2 重組質粒pMD19-T-Der f1雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzymeanalysis of the recombinant plasm ids pMD19-T-Der f1

圖3 植物表達載體PVX-Der f1雙酶切鑒定Fig.3 Determ ination of the exp ression p lasm ids PVX-Der f1 by restriction enzyme digestion

2.3 粉塵螨變應原第1組分煙草葉片表達產物SDS-PAGE分析 煙草葉片蛋白粗提物經0.22μm膜過濾后,進行SDS-PAGE分析,有4株煙草葉片蛋白提取物在34Mr處有特異性蛋白條帶,即第2、3、4和6株煙草,而第1、5、7、8株煙草葉片提取物中均未出現(xiàn)此條帶（圖4）。

2.4 粉塵螨變應原第1組分煙草葉片表達產物的純化 將第2、3、4和6株煙草葉片蛋白提取物混合物用鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱分離純化,經SDSPAGE 電泳分析顯示,用 25、50、75、100、125、150 mmol/L不同濃度的咪唑溶液均可洗脫獲得目的蛋白（圖5）。收集這幾個洗脫液,冷凍干燥后共獲得約2.26mg重組蛋白純品,濃度為16.33mg/g（重組蛋白/可溶性蛋白）。

圖4 粉塵螨變應原第1組分煙草葉片表達產物的 SDSPAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE analysis of rDer f1 in the leaves of Nicotiana bentham iana

圖5 Der f1煙草葉片表達產物純化組分的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein rDer f1 in the leaves of Nicotiana bentham iana

圖6 Western blot鑒定Der f1煙草葉片表達產物變應原性Fig.6 Western blotanalysis of rDer f1 expression in the leaves of Nicotiana bentham iana

2.5 Western blot鑒定重組蛋白變應原性 將第2、3、4和6株煙草葉片重組蛋白的純化產物,用Western blot進一步驗證其變應原性,結果顯示,煙草葉片中獲得的重組蛋白在34Mr處與陽性血清發(fā)生特異性結合,而與陰性血清并不發(fā)生結合,表明Der f1煙草葉片表達產物可與粉塵螨特異性IgE發(fā)生結合,見圖 6。

3 討論

近年來,利用植物病毒載體表達外源基因已經成為生命科學領域的研究熱點之一,隨著載體構建策略的不斷完善,多種病毒將被用于構建不同類型的載體,從而表達各種不同目的的外源基因,同時更多的醫(yī)用蛋白或疫苗將在植物中得以表達。馬鈴薯X病毒（Potato virus X,PVX）基因組是單股正鏈RNA,長度約為6.4 kb,5′端有 m7GpppG 帽結構,3′端有poly（A）尾,它包括5個ORF。ORF1編碼 165 kD RNA聚合酶,是RNA合成所必需的唯一的來源于病毒的蛋白質;ORF2-ORF4三個基因互相重疊,稱為三基因區(qū)段,分別編碼 25、12、8 kD蛋白,這些蛋白與病毒在細胞間的移動有關,稱為移動蛋白;其中25 kD已被證明是一種轉錄后基因沉默的抑制因子,打破寄主植物的防御反應,使病毒成功侵染[7]。ORF5編碼PVX的25 kD外殼蛋白亞基,除了包裝核酸外,還是病毒細胞間移動所必需的,并且在復制調節(jié)上也起重要作用。

本實驗使用英國Sainsbury實驗室David Baulcombe等提供的PVX載體PGR107,含CaMv35S啟動子,Nos終止子,抗性篩選標志為kanr。在PVX外殼蛋白（CP）啟動子前再插入一個拷貝的CP啟動子,用以啟動目的基因的轉錄。在兩個啟動子之間,利用cla I和sal I酶切位點引入外源基因。我們從原核表達質粒pET28a（+）-Der f1擴增獲得塵螨主要變應原Der f1基因,將其插入PVX載體中,酶切鑒定結果顯示已成功構建PVX-Der f1。

植物病毒作為載體表達外源基因,具有瞬時表達的特點,一般在病毒侵染后1～2周外源蛋白表達量積累到高峰。Zhou等[8]將人GM-CSF編碼基因插入PVX載體上,并侵染煙草葉片,結果發(fā)現(xiàn)位于煙草頂端的嫩葉中可溶性蛋白含量高于底端的老葉片,且在侵染10天后,蛋白表達水平達到高峰。本研究以膿桿菌介導PVX-Der f1侵染8株煙草,侵染后第11天采集頂端葉片,SDS-PAGE顯示有4株煙草中含有Der f1的編碼蛋白。在引物設計和合成時,我們將組氨酸標記引入目的基因。采用鎳瓊脂糖凝膠親和層析分離純化后,SDS-PAGE分析表明不同濃度的咪唑溶液均可洗脫獲得目的蛋白,證實重組蛋白中為Der f1和組氨酸的融合產物。

用粉塵螨粗提浸液進行皮膚挑刺試驗、選擇哮喘患兒陽性血清為一抗,生物素化羊抗人IgE為二抗,Western blot分析表明該重組蛋白可與粉塵螨特異性IgE發(fā)生結合,因此Der f1煙草葉片表達產物具有較好的變應原性。

1 Roche N,Chinet TC,BelouchiN Eetal.Dermatophagoidespteronyssinus and bioelectric properties of airway epithelium:role of cysteine proteases[J].Eur Respir J,2000;16（2）:309-315.

2 崔玉寶,何 珍,李朝品.居室環(huán)境中螨類的孳生與疾病[J].環(huán)境與健康雜志,2005;22（6）:500-502.

3 Thomas W R,Wendy-Anne Smith,Hales B J.Characterization and immunobiology of house dustmite allergens[J].IntArch Allergy Immunology,2002;129（1）:1-18.

4 ThomasW R,SmithW A,Hales B Jetal.The allergenic specificities of the house dustmite[J].Chang Gung Med J,2004;27（8）:563-569.

5 杜小春,何正權,陳 磊etal.植物生物反應器表達藥用蛋白研究新進展[J].中國生物工程雜志,2008;27（9）:135-143.

6 牛顏冰,史正文,王德富etal.重組馬鈴薯X病毒注射番茄果實高效表達胸腺素α1[J].生物工程學報,2009;25（4）:537-541.

7 Módena N A,Zelada AM,Conte Fetal.Phosphorylation of the TGBp1 movement protein of Potato virus X by a Nicotiana tabacum CK2-like activity[J].V irusRes,2008;137（1）:16-23.

8 Zhou F,WangM L,A lbertHHetal.Efficient transientexpression ofhuman GM-CSF protein in Nicotiana benthamianausing potatovirus X vector[J].ApplMicrobiol Biotechnol,2006;72（4）:756-762.

[收稿2009-10-15 修回2009-12-08]

（編輯 許四平）

Plant vector construction and expression of Der f1 allergen of Dermatophagoides pteronyssinu

PENGJiang-Long,CUIYu-Bao,WANGHua-Min,ZHOUYING,NIULi-Na,WUJie.DepartmentofMicrobiologyand Immunology,HainanMedicalCollege,Haikou571101,China

Objective:To construct the plantexpression vector of Der f1 allergen of Dermatophagoides pteronyssinu and expression in tobacco lamina.Methods:The Der f1 genewas amp lified from theglycerin bacterium which contained pET28a（+）-Der f1 plasmid,cloned into the pMD 19-T plasm id,and then sequenced.The Der f1 genewas digested by ClaⅠand SalⅠ ,and cloned into potato virus X（PVX）to constructp lant expression vector PVX-Der f1,and then was transformed agrobacterium tumefaciens.The positive onewas selected to infect tobacco lamina for expressing target protein.The protein was identified and analysed by SDS-PAGEand Western blot.Results:Digestion and sequence analysis confirmed that the plantexpression vectorwas correct,and the SDS-PAGE and Westernblot results showed that themolecularweightof the protein was about34Mrand itcould specific bindingwith positive serum.Conclusion:The plantexpression vector of Der f1 is successfully constructed and the recombinant p rotein is also produced.

Dermatophagoides pteronyssinu;Der f1;Potato virus X（PVX）;Plantexpression

R384.4

A

1000-484X（2010）03-0250-04

①本課題為國家自然科學基金（30860261）、海南省自然科學基金（807070）

②鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術學院衛(wèi)生技術研究所,鹽城224006

彭江龍（1972年-）,男,碩士,講師,主要從事病原生物學與變態(tài)反應性疾病的研究,E-mail:37584476@163.com。