馮燕梅 羅永艾 江 濤 韓曉黎 彭 麗 吳玉蓉

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶400016)

卡氏肺孢子菌pVAX-p55-v3及pVAX-p55-v0真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定

馮燕梅 羅永艾 江 濤 韓曉黎 彭 麗 吳玉蓉

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶400016)

目的:構(gòu)建卡氏肺孢子菌p55-v3及p55-v0抗原基因真核表達(dá)載體,mRNA水平鑒定其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)。方法:以卡氏肺孢子菌總RNA為模板,RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增p55-v3及p55-v0抗原基因,連接至pTA2載體,再克隆到pVAX1真核表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0。重組質(zhì)粒在感受態(tài)DH5α大腸桿菌中大量擴(kuò)增后,轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞, RT-PCR鑒定其在mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果:構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定,與文獻(xiàn)報道的同源性分別達(dá)到99.8%和99.9%;其編碼的氨基酸與文獻(xiàn)報道的同源性為100%。RT-PCR顯示p55-v3和p55-v0成功轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞,并在其中進(jìn)行基因表達(dá)。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0重組質(zhì)粒,并在COS-7細(xì)胞中表達(dá),為進(jìn)一步闡明p55-v3的免疫保護(hù)功能以及核酸疫苗的研究提供了基礎(chǔ)。

卡氏肺孢子菌;p55-v3及p55-v0;真核表達(dá)

卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,PC)是一種涉及人和多種哺乳動物的機(jī)會感染性真菌,其中感染人的卡氏肺孢子菌已經(jīng)更名為耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci,PC),它所引起的耶氏孢子菌肺炎(Pneumocystis jirovecipneumonia,PCP)是各種先天或后天免疫機(jī)能低下的患者(如艾滋病、器官移植、腫瘤放化療等)常見的并發(fā)癥和主要的死亡原因之一。近年來,由于艾滋病患者人數(shù)增加及免疫抑制劑的應(yīng)用增多,PCP的發(fā)病率呈上升趨勢。因此,及時有效預(yù)防和治療PCP并進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究具有重要的意義。

大鼠源P55抗原蛋白分子量為45～55 kD,它是在早期感染肺孢子菌的大鼠呼吸道中發(fā)現(xiàn)的一種明顯的抗原組分,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[1,2]。近年來,Ma等[3]研究發(fā)現(xiàn)p55抗原基因存在多樣性,他們分別克隆了p55-v1～v4,其中p55-v3與Smulian[4]克隆的p55-v0結(jié)構(gòu)上存在差異,并且定位于不同的染色體上。由于其結(jié)構(gòu)和位置的不同,推測機(jī)體在感染PC的過程中,p55-v3和p55-v0刺激宿主免疫反應(yīng)時可能發(fā)揮了不同的作用。本文通過對上述兩種抗原基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、序列分析,并在COS-7細(xì)胞中對其表達(dá)效率進(jìn)行研究,有利于進(jìn)一步闡明p55-v3的免疫保護(hù)功能,從而為闡明PC與宿主相互作用的分子機(jī)制及新型疫苗的研制提供基礎(chǔ),為PCP防治提供一種新的方法和手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。RNAisoTMPlus,RT-PCR試劑盒(兩步法),限制性內(nèi)切酶 K pnⅠ、ApaⅠ及T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司;DNA膠回收試劑盒及Bio MarkerⅢ購自BioFlux公司;PCR純化試劑盒購自北京蓋寧生物科技有限公司;其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 動物模型 根據(jù)文獻(xiàn)[5]報道清潔級雌性SD大鼠,體重200克左右(由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供),注射地塞米松誘導(dǎo)PCP,建立動物模型。

1.3 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞 TA rget cloneTM-Plus-購自TOY OBO公司。真核表達(dá)載體pVAX1購自Invitrogen公司。感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。COS-7細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院提供。

1.4 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)p55-v0和p55-v3的基因序列CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物。運(yùn)用Primer5.0和Oligo6.0分析引物的可行性,用Blastn對其同源性進(jìn)行

1.5 總RNA的提取 取病原學(xué)確診的重度PC感染的肺組織約50 mg,按RNAisoTMPlus試劑說明書抽提總RNA。用核酸蛋白定量檢測儀測定RNA濃度及OD260/OD280,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。

1.6 p55-v3和p55-v0基因擴(kuò)增及亞克隆 按照試劑盒說明書進(jìn)行兩步法RT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為50μl。p55-v3及p55-v0反應(yīng)條件均為94℃預(yù)變性5分鐘,94℃變性30秒,55℃延伸30秒,72℃延伸60秒,共35個循環(huán)。最后72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物按膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收后與T載體連接。PCR產(chǎn)物2μl,pTA2 vector 1μl,2×ligation Buffer 5μl,T4 DNA Ligase 1μl,雙蒸水補(bǔ)足10μl,室溫反應(yīng)30分鐘。然后用制備好的感受態(tài)大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將10μl連接液加入感受態(tài)細(xì)胞(200μl)中輕輕混勻后冰浴30分鐘,42℃熱休克30秒,冰浴冷卻2分鐘。加SOC培養(yǎng)基900μl,于37℃振動培養(yǎng)1小時。取適量涂于LB/AP/IPTG/X-gal板上,于37℃過夜培養(yǎng)。通過藍(lán)白判定挑出白色重組菌落接種于抗Amp的LB培養(yǎng)液中37℃,200 r/min震蕩培養(yǎng)12小時。次日取1μl菌液PCR鑒定(條件同前),同時用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒后用K pnⅠ及ApaⅠ進(jìn)行酶切鑒定。取陽性重組質(zhì)粒送sangon測序鑒定并運(yùn)用DNAstar軟件分析測序結(jié)果。

1.7 真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 分別將測序正確的重組載體pTA-p55-v3、pTA-p55-v0及pVAX1用K pnⅠ及ApaⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后運(yùn)用膠回收試劑盒及PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收大小分別約1 054 bp、1 253 bp及3 000 bp的DNA片段。分別將酶切后的p55-v3、p55-v0與回收的pVAX1片段用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,運(yùn)用卡那霉素(50μg/ml)作為抗性陽性篩選,挑取陽性克隆擴(kuò)增并小量提取質(zhì)粒DNA。對質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.8 轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并檢測目的基因mRNA的表達(dá)COS-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEMF12中,于轉(zhuǎn)染前24小時收集細(xì)胞并接種于50 ml培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞密度為3×105ml-1,在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24小時,使每瓶細(xì)胞密度達(dá)到90%左右。與此同時根據(jù)無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒說明書抽提質(zhì)粒pV AX-p55-v3、pV AX-p55-v0及pV AX1,然后運(yùn)用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染所抽提質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染后24小時運(yùn)用RT-PCR法檢測目的基因mRNA的表達(dá),目的基因及內(nèi)參(G APDH)PCR條件同前。

2 結(jié)果

2.1 PC總RNA的提取 提取的總RNA經(jīng)核酸蛋白定量檢測儀測定濃度為 2.045μg/μl,OD260/ OD280為1.937,1%瓊脂糖凝膠電泳5S、18S、28S三條帶均可見(圖1),說明總RNA達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求,可以進(jìn)行RT-PCR。

2.2 p55-v3和p55-v0基因的克隆 以PC總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,分別加入特異性引物P1、P2和P3、P4,所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析分別在1200bp、1000bp左右處可見一特異性條帶,與預(yù)期大小相符(圖2)。將片段克隆入pTA2載體,獲得陽性重組克隆pTA-p55-v3、pTA-p55-v0,PCR及雙酶切鑒定結(jié)果所得質(zhì)粒為重組載體(圖3、圖4)。經(jīng)測序及DNAstar軟件分析所得兩個重組載體分別為p55-v3、p55-v0抗原基因片段,p55-v0兩個堿基發(fā)生突變,210位C-G、475位A-G。p55-v3一處堿基發(fā)生突變,1 021位T-C,與文獻(xiàn)報道的同源性分別達(dá)到99.8%和99.9%;其編碼的氨基酸與文獻(xiàn)報道的同源性為100%。而p55-v3和p55-v0之間的同源性為20.9%。

圖1 PC感染鼠肺組織總RNAFig.1 Total RNA of lung tissues from PC infected rat

圖2 p55-v0及p55-v3基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定Fig.2 Identification of RT-PCR product of p55-v0 and p55-v3 gene

2.3 pV AX1-p55-v3和pV AX1-p55-v0真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將pT A-p55-v3、pT A-p55-v0重組質(zhì)粒用K pnⅠ、ApaⅠ雙酶切,獲得p55-v3、p55-v0抗原基因片段,再將其克隆至真核表達(dá)載體pV AX1,構(gòu)建重組載體pV AX-p55-v3、pV AX-p55-v0,經(jīng)酶切鑒定表明p55-v3、p55-v0抗原基因片段已成功克隆入pV AX1載體(圖5)。

2.4 RT-PCR鑒定重組載體在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)

pVAX-p55-v0、pVAX-p55-v3及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后24小時,提取總RNA,進(jìn)行RT-PCR,1%瓊脂糖凝膠電泳觀察(圖6)可見重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(泳道1、2)有明顯的特異性條帶,分別位于1 200 bp及1 000 bp左右,其大小與p55-v0及p55-v3基因片段一致,而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組僅見內(nèi)參(G APDH)條帶,未見特異性條帶。表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的p55-v0及p55-v3基因在COS-7細(xì)胞中有表達(dá)。

圖3 重組質(zhì)粒pTA-v0、pTA-v3的PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pTA-v0/pTA-v3 by PCR

圖4 重組質(zhì)粒pT A-v0、pT A-v3的KpnⅠ、ApaⅠ雙酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pTA-v0/pTA-v3 digested with KpnⅠand ApaⅠ

圖5 重組真核表達(dá)載體pVAX-p55-v3、pVAX-p55-v0的酶切鑒定Fig.5 Identification of recombinant eukaryotic expression vector pVAX-p55-v3,pVAX-p55-v0 by enzyme digesting

圖6 轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞mRNA水平的表達(dá)Fig.6 mRNA expression of the transfected COS-7 cells

3 討論

PC免疫診斷和免疫預(yù)防、治療的關(guān)鍵問題是抗原。而由于PC培養(yǎng)困難,很難成批供應(yīng)大量高純度的PC抗原蛋白,同時由于PC抗原成分復(fù)雜,抗原變異較大,因此利用DNA重組技術(shù)制備大量高純度抗原,對于免疫診斷、預(yù)防和治療均具有重要意義。

P55是卡氏肺孢子菌細(xì)胞壁上的一種組分抗原。Smulian等[2,4]克隆并鑒定了肺孢子菌55 kD抗原基因(p55-v0),將重組P55-V0抗原主動免疫大鼠后能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。Ma等[3]克隆了p55-v3基因(GenBank:AY768940),通過比較發(fā)現(xiàn)p55-v3和p55-v0基因5′端存在較大差異,3′端均為高度保守區(qū)域但兩者重復(fù)區(qū)域的氨基酸種類和數(shù)目存在差異;p55-v0包含一個N-連接糖基化位點(diǎn)和RG D連接位點(diǎn)而p55-v3卻沒有;同時染色體雜交發(fā)現(xiàn)p55-v3主要位于第4染色體而p55-v0主要位于第2染色體。然而P55-V3是否和P55-V0一樣能對宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)及其作用機(jī)制如何,目前尚不是很清楚。

pVAX1是目前唯一符合FDA標(biāo)準(zhǔn)的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體。它是一種分子量為3.0kb的真核表達(dá)載體。其Kan選擇抗性和多克隆酶切位點(diǎn)能夠克隆大片段目的基因。啟動子CMV和BGH polyA信號可以在哺乳動物細(xì)胞中高表達(dá)重組蛋白。迄今為止,關(guān)于pVAX1的研究已經(jīng)廣泛涉及到臨床各個方面[6-8]。本研究克隆了p55-v3和p55-v0基因,并構(gòu)建pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,RT-PCR在mRNA水平檢測其表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0轉(zhuǎn)染組能擴(kuò)增出相應(yīng)的基因片段,而空載體組不能,表明p55-v3和p55-v0基因片段在真核細(xì)胞內(nèi)RNA水平有轉(zhuǎn)錄。這為進(jìn)一步研究p55-v3的免疫功能,比較p55-v3和p55-v0的免疫作用機(jī)制以及PC DNA疫苗的研究提供了基礎(chǔ)。

致謝:本研究得到美國NIH馬良博士的指導(dǎo),特此感謝!

1 Theus S A,Sullivan D W,Walzer P Det al.Cellular responses to a 55-kilodalton recombinant Pneumocystis carinii antigen[J].Infect Immun, 1994;62(8):3479-3484.

2 Smulian A G,Sullivan D W,Theus S A.Immunization with recombinant Pneumocystis carinii p55 antigen provides partial protection against infection:characterization of epitope recognition associated with immunization [J].Microbes Infect,2000;2(2):127-136.

3 Ma L,Kutty G,Jia Qet al.Characterizationof variantsof the gene encoding the p55 antigen in Pneumocystis from rats and mice[J].J Med Microbiol,2003;52(Pt 11):955-960.

4 Smulian A G,Theus SA,Denko Net al.A 55 kDa antigenof Pneumocystis carinii:analysis of the cellular immune response and characterization of the gene[J].Mol Microbiol,1993;7(5):745-753.

5 張 帆,盧思奇,王鳳云 et al.卡氏肺孢子蟲低死亡率sd大鼠動物模型的建立[J].中國寄生蟲病防治雜志,2005;18(2):99-102, F002.

6 Feng C Y,Li Q T,Zhang X Yet al.Immune strategies using single-component LipL32 and multi-component recombinant LipL32-41-OmpL1 vaccines against leptospira[J].Braz J Med Biol Res,2009;42(9):796-803. 7 Wang X,Xu W,K ong Xet al.Modulation of lung inflammation by vessel dilator in a mouse model of allergic asthma[J].Respir Res,2009;10(1): 66-73.

8 Yang Y P,Li Y H,Zhang A Het al.G ood Manufacturing Practices production and analysis of a DNA vaccine against dental caries[J].Acta Pharmacol Sin,2009;30(11):1513-1521.

[收稿2009-10-19 修回2009-11-19]

(編輯 倪 鵬)

Construction and identification of pneumocytis cariniieukaryotic expression plasmids of pVAX-p55-v3 and pVAX-p55-v0 antigenic gene

FENG Yan-Mei,LUO Yong-Ai,JIANG Tao,HAN Xiao-Li,PENGLi,WU Yu-Rong.Department of Respiratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing400016,China

Objective:T o construct eukaryotic expression plasmids ofpneumocystis cariniip55-v3 and p55-v0 antigenic genes and to identify their expression in COS-7 cells at mRNA level.Methods:Pneumocystis cariniitotal RNA was used as the template to amplify p55-v3 and p55-v0 antigenic gene by RT-PCR.The products were connected to pTA2 vector and then cloned in pVAX1 eukaryotic expression vector to construct recombinant plasmids as pVAX-p55-v3 and pVAX-p55-v0.After propagated inE.coliDH5α,the recombinant plasmids were transfected into COS-7 cells.After 24 h incubation,the RT-PCR was performed to identify the mRNA expression of p55-v3 and p55-v0 antigenic gene.Results:The recombinant plasmids were qualified by restrictive endonuclease digestion and sequencing.And when compared with that in GenBank,the homologyof p55-v3 antigenic gene was 99.9%in nucleotides and 100%in amino acid.The homology between p55-v0 antigenic gene and the one reported previously in nucleotide and amino acid seguence were 99.8%and 100%.The results of RT-PCR confirmed that p55-v3 and p55-v0 antigenic geneswere transfected into COS-7 cells successfully and the geneswere expressed in the cells.Conclusion:In this study,the recombinant plasmidsof pVAX-p55-v3 and pVAX-p55-v0 are conducted successfully and expressed in the COS-7 cells,which provide a basis for clarification of immunologic function of p55-v3 and study of DNA vaccine.

Pneumocystis carinii;p55-v3 and p55-v0;Eukaryotic cell expression

R379.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)03-0214-04

馮燕梅(1982年-),女,在讀博士,主要從事卡氏肺孢子菌肺炎免疫治療方面的研究,E-mail:gg-mm@126.com;

及指導(dǎo)教師:羅永艾(1942年-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事免疫治療方面的研究;E-mail:luoyongai1942@163.com。