張 宇 賀 丹 王 麗 (吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,長(zhǎng)春130021)

真菌是自然界中廣泛存在的一類重要微生物,與人類的生產(chǎn)、生活密切相關(guān)。絲狀真菌作為其中的類群,在食品、藥品、酶劑、有機(jī)酸的生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)的生物防治等方面發(fā)揮著極大的作用。但另一方面,其中某些種屬也是人和動(dòng)、植物的重要致病菌[1,2]。為了有效地開發(fā)利用真菌資源,防治真菌病害、控制真菌感染,研發(fā)新型抗真菌藥物和真菌疫苗,有關(guān)絲狀真菌代謝途徑、致病機(jī)制等的研究尤為重要。

絲狀真菌是多細(xì)胞真核生物,其生長(zhǎng)、代謝等活動(dòng)是復(fù)雜的過程,在復(fù)雜的系統(tǒng)中完成。在各系統(tǒng)中,有一些功能單元,它們協(xié)同作用并互相整合,其最終執(zhí)行者就是蛋白質(zhì)。以往的研究只是針對(duì)某種或幾種“關(guān)鍵”蛋白質(zhì),難以從整體上系統(tǒng)地闡釋生命活動(dòng)的機(jī)制。隨著后基因組時(shí)代的到來,蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)絲狀真菌的生命活動(dòng)、致病機(jī)制、代謝途徑等研究起到了極大的推進(jìn)作用。

雙向凝膠電泳可以同時(shí)分離上千種蛋白質(zhì),并且與后續(xù)的質(zhì)譜(如：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matri assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS))和大規(guī)模數(shù)據(jù)處理及圖像分析軟件相銜接,形成了蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)。但是存在著檢測(cè)靈敏度低、染色方法與質(zhì)譜難以整合、低豐度蛋白質(zhì)無法鑒定等問題。近年來,同位素標(biāo)記和熒光標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用、串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定技術(shù)的開展、肽序列標(biāo)簽(Peptide sequence tag,PST)技術(shù)的應(yīng)用很大程度上促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。

本文主要從絲狀真菌的胞內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)、亞蛋白質(zhì)組學(xué)和分泌蛋白質(zhì)組學(xué)三個(gè)方面進(jìn)行闡述。

1 胞內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)(Intracellular proteomics)

在絲狀真菌,最初是針對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。2002年,Herna′ndez-Macedo等[3]率先開展了胞內(nèi)蛋白質(zhì)組研究。他們應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù),比較了木質(zhì)素降解菌黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)在鐵存在和缺失狀態(tài)下,胞內(nèi)蛋白質(zhì)的差異表達(dá),發(fā)現(xiàn)了21種與鐵吸收相關(guān)的蛋白質(zhì)。2004年,Grinyer等[4]首次將質(zhì)譜測(cè)定法用于絲狀真菌蛋白質(zhì)的鑒定。他們?cè)诠哪久?Trichoderma harzianum)蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜中選擇96個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),利用質(zhì)譜技術(shù)得到肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting,PMF),通過檢索數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出其中25個(gè),如熱休克蛋白、磷酸甘油酸酯激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶等。這些開創(chuàng)性的工作極大地推動(dòng)了絲狀真菌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系也不斷成熟和發(fā)展,并用于絲狀真菌的代謝途徑、致病機(jī)制等方面的研究。

煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是非常重要的條件致病菌,相關(guān)研究成為熱點(diǎn)。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,可以獲得環(huán)境變化和外界壓力條件下菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)變化,如對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等[5]。這其中的許多蛋白質(zhì)與致病性或毒力因子的調(diào)節(jié)相關(guān),如熱休克蛋白、硫氧還蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶以及超氧化物歧化酶等,他們?cè)诰晏幱谘趸瘧?yīng)激狀態(tài)時(shí)的表達(dá)量增高,使菌體避免宿主免疫細(xì)胞的損傷作用,參與菌株的致病過程。蛋白質(zhì)組學(xué)方法也可以發(fā)現(xiàn)新的抗原,為煙曲霉感染疾病的診斷提供候選標(biāo)志物。此外,蛋白質(zhì)組學(xué)方法也可用于研究菌株代謝途徑的調(diào)節(jié)。Kniemeyer等[6]比較了不同碳源存在時(shí),煙曲霉的胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)情況,闡述了其碳代謝的抑制因素。Carberry和Martin等[5,7]鑒定出的蛋白質(zhì)如丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、烏頭酸水合酶、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白亞單位等,這些蛋白質(zhì)都是菌株糖類、脂類、蛋白質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵酶,功能涉及細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)等。這些數(shù)據(jù)不僅完善了煙曲霉蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),還將為深入探討煙曲霉的致病機(jī)制以及生長(zhǎng)代謝的過程提供資料。其他條件致病菌的相關(guān)研究也不斷深入。K im等[8]將構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)和產(chǎn)乳酸菌共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)菌株形態(tài)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平發(fā)生了變化。Leng等[9]研究了紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)分生孢子的蛋白質(zhì)組,發(fā)現(xiàn)許多特異蛋白質(zhì)與孢子的生長(zhǎng)和播散相關(guān),可以更好地研究分生孢子萌發(fā)和維持休眠狀態(tài)的分子機(jī)制,為闡明菌株的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)組學(xué)方法為一些植物致病菌感染過程的研究提供了重要信息。Fernández-Acero等[10]建立了灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),功能主要涉及蛋白質(zhì)代謝、形態(tài)變化和氧化還原活性等,如草酸、漆酶、過氧化氫酶等。這些蛋白質(zhì)在菌體侵染植物時(shí),釋放出能夠清除活性氧的代謝產(chǎn)物,保護(hù)菌體不受損傷,為植物病害的判斷和殺菌劑的開發(fā)提供了良好的來源。另一種植物致病菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的蛋白質(zhì)組圖譜的繪制也已完成[11],推測(cè)其中的α-L-阿拉伯呋喃糖酶與致病性相關(guān)。Noir等[12]研究經(jīng)水仙花堿作用后布氏白粉菌(Blumeria graminisf)的分生孢子蛋白質(zhì)組圖譜。鑒定出180種蛋白質(zhì),功能涉及糖類、脂類和蛋白質(zhì)的分解代謝,說明此時(shí)孢子已為增殖、萌發(fā)儲(chǔ)備能量,參與侵染植物的過程。Lakshman等[13]分離了立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì),鑒定出11種與生物防治功能相關(guān)的蛋白質(zhì),探討了其生物功能以及宿主與病原菌間的相互作用。

雖然已在整體水平上逐漸勾畫出絲狀真菌的代謝和致病過程相關(guān)的蛋白質(zhì)組圖譜,但仍存在著一些問題,如位于細(xì)胞器上許多重要的調(diào)節(jié)分子(如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、細(xì)胞調(diào)節(jié)因子及轉(zhuǎn)錄因子)和疏水性、堿性蛋白質(zhì)很難被檢測(cè)到。因此,目前,絲狀真菌蛋白質(zhì)組研究的熱點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向亞細(xì)胞(如細(xì)胞壁、質(zhì)膜、細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核)的蛋白質(zhì)。

2 亞蛋白質(zhì)組學(xué)(Subproteomics)

亞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是亞細(xì)胞(如細(xì)胞壁、質(zhì)膜、細(xì)胞器等)的全部蛋白質(zhì)[14]。細(xì)胞壁是微生物與外界環(huán)境相互作用的直接界面。它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,錨定和排列著許多蛋白質(zhì),在形態(tài)發(fā)生、粘附、致病性、抗原性方面發(fā)揮著重要作用。其中許多已經(jīng)成為抗真菌藥物研發(fā)的潛在靶標(biāo)。但由于其低豐度、低溶解性、疏水性、廣泛的糖基化以及共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞壁的多糖骨架上等原因,許多細(xì)胞壁蛋白質(zhì)難以分析。Pitarch等人[15]建立了絲狀真菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)提取方法,并進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。不僅得到了蛋白質(zhì)組圖譜,而且提出了蛋白質(zhì)間以及蛋白質(zhì)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)間的相互作用機(jī)制。張成省等[16]以鏈格孢霉(Alternaria alternata)為研究對(duì)象,比較了冷堿、熱堿和SDS法提取菌絲細(xì)胞壁可溶性蛋白質(zhì)的方法,為探討病原菌與宿主間的相互識(shí)別機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Asif等[17]為了研究煙曲霉?jié)撛诘乃幬锇悬c(diǎn),繪制了該菌的質(zhì)膜表面蛋白質(zhì)組圖譜。利用細(xì)胞壁和質(zhì)膜的亞蛋白質(zhì)組學(xué),可以系統(tǒng)地研究菌株的蛋白質(zhì)分泌和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)等。

線粒體的相關(guān)研究也成為熱點(diǎn)。Grinyer等[18]首次建立了成熟的樣品制備方法,得到哈茨木霉線粒體蛋白質(zhì)組圖譜,鑒定出25種線粒體特有蛋白質(zhì),其功能涉及三羧酸循環(huán)、分子伴侶、受體結(jié)合與運(yùn)輸以及結(jié)構(gòu)蛋白等方面。Schmitt等[19]分析了粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的線粒體質(zhì)膜蛋白質(zhì)組,鑒定出30種蛋白質(zhì),其功能涉及物質(zhì)運(yùn)輸和線粒體形態(tài)變化等。

Grinyer等[20]也首次分離和鑒定出里氏木霉(Trichoderma reesei)20S蛋白酶體的13個(gè)亞基,繪制了絲狀真菌蛋白酶體的蛋白質(zhì)組圖譜。

這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：以細(xì)胞器蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象,與胞內(nèi)總蛋白質(zhì)相比,降低了樣品的復(fù)雜性,而且細(xì)胞的功能單位如細(xì)胞器、大分子結(jié)構(gòu)或多蛋白復(fù)合體也不會(huì)遭到破壞,可以獲得低豐度的調(diào)節(jié)分子和疏水性、堿性蛋白質(zhì),亦可以在特定細(xì)胞器的特定生理狀態(tài)下深入了解蛋白質(zhì)的功能。

3 分泌蛋白質(zhì)組學(xué)(Secretome)

分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是絲狀真菌分泌蛋白質(zhì)和與分泌過程相關(guān)蛋白質(zhì)[21]。絲狀真菌是腐生菌,需要分泌大量的胞外酶來降解多種物質(zhì),以攝取養(yǎng)分、改善生存環(huán)境等。對(duì)這些分泌蛋白質(zhì)的研究不但有助于了解其代謝途徑和致病機(jī)制[7,11],而且在重組蛋白的生產(chǎn)中也有著重要意義[22]。Medina等[23]初步建立了真菌分泌蛋白質(zhì)組樣品制備方法,鑒定出蘆丁誘導(dǎo)下黃曲霉(Aspergillus flavus)分泌參與降解的蛋白質(zhì)。Oda等[24]發(fā)現(xiàn)了在液體和固體培養(yǎng)狀態(tài)下米曲霉(Aspergilllus oryzae)分泌蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。Suárez等[25]比較了以幾丁質(zhì)或其他真菌(絲核菌(Rhizoctonia solani)和灰葡萄孢霉等)細(xì)胞壁為唯一碳源時(shí),哈茨木霉的分泌蛋白質(zhì)表達(dá)存在顯著差異,表達(dá)量最高的均是一種新型的天冬氨酸蛋白酶(P6281),提示這種蛋白質(zhì)在其腐生生活中起主要作用。Paper等[26]鑒定了禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)的分泌蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)時(shí)91%～100%的分泌蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽;感染小麥時(shí),只有56%的分泌蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽,提示這些蛋白質(zhì)在禾谷鐮刀菌與其宿主植物的相互作用中發(fā)揮著重要作用。

分泌蛋白質(zhì)的分泌量少,低豐度蛋白質(zhì)獲取困難,因此開展全部分泌蛋白的研究較少。但研究分泌蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是：菌株的生長(zhǎng)環(huán)境便于控制,蛋白質(zhì)獲取過程直接,其他來源(如細(xì)胞內(nèi)、質(zhì)膜等)蛋白質(zhì)的干擾較少等。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,低豐度蛋白質(zhì)的富集成為可能,絲狀真菌的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究必將迅速開展。

綜上,近年來由于高通量、高靈敏度和規(guī)?；碾p向凝膠電泳-質(zhì)譜等技術(shù)的飛速發(fā)展,絲狀真菌蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)取得了較大的成果。雖然作為“新生”領(lǐng)域,仍存在著一些不足,但隨著先進(jìn)技術(shù)方法的不斷產(chǎn)生和完善、基因組學(xué)與生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及政府投資與商業(yè)投入的不斷增加,絲狀真菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究必將在21世紀(jì)取得突破性的進(jìn)展。

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