廖 偉 安曉靜 錢桂生 趙聰敏 （第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院兒科,重慶 400037）

脂質(zhì)體介導(dǎo)的IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟樹突狀細(xì)胞對其成熟性及功能的影響①

廖 偉 安曉靜②錢桂生②趙聰敏 （第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院兒科,重慶 400037）

目的:探討脂質(zhì)體介導(dǎo)的IDO基因轉(zhuǎn)染對未成熟樹突狀細(xì)胞（Immature dendritic cells,imDCs）的成熟性及功能的影響。方法:從BALB/c小鼠骨髓培養(yǎng)imDCs,形態(tài)學(xué)觀察后用流式細(xì)胞術(shù)鑒定imDC后,將其分為IDO+-imDC組:重組pEGFPN1-IDO質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染imDCs;IDO--imDC組:pEGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染imDCs;imDCs組:imDCs不做特殊處理;mDC組:將培養(yǎng)的imDC用TNF-α誘導(dǎo)成熟。流式細(xì)胞術(shù)檢測IDO基因轉(zhuǎn)染im DC細(xì)胞后細(xì)胞表型是否發(fā)生變化。Western b lot檢測各組IDO蛋白表達(dá)?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)檢測各組在體外刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果:BALB/c小鼠骨髓培養(yǎng)的細(xì)胞表面標(biāo)志和細(xì)胞形態(tài)符合imDCs典型特征;Western blot結(jié)果顯示IDO+-imDC組可見IDO蛋白表達(dá);IDO+-imDC組細(xì)胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ表達(dá)率分別為（9.4±2.2）%、（8.7±1.1）%、（11.4±2.6）%,imDC 組分別為（8.5±1.8）%、（7.5±1.6）%、（10.2±2.1）%,兩組比較無顯著差異（P均＞0.05）,IDO+-imDC組在體外刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯低于imDC組（678±90.3vs1 199±275.5,P＜0.01）。結(jié)論:脂質(zhì)體介導(dǎo)的IDO基因轉(zhuǎn)染imDCs能維持細(xì)胞于未成熟狀態(tài),在MLR中,對T細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。

吲哚胺2,3-雙加氧酶;樹突細(xì)胞;脂質(zhì)體;轉(zhuǎn)染

吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）是色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶,而色氨酸是T細(xì)胞活化增殖過程中合成蛋白質(zhì)所必需的氨基酸。已證實(shí)在小鼠體內(nèi)表達(dá)IDO的抗原提呈細(xì)胞（Antigen presenting cell,APC）在局部組織微環(huán)境通過耗竭色氨酸而阻斷T細(xì)胞周期使活化的T細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞耐受[1]。同時(shí)新近研究表明,未成熟樹突狀細(xì)胞（Immature dendritic cells,imDCs）通過刺激初始型T細(xì)胞分化成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）產(chǎn)生誘導(dǎo)免疫耐受形成[2,3]。因此本研究以脂質(zhì)體介導(dǎo)IDO基因轉(zhuǎn)染imDCs,觀察IDO表達(dá)及imDCs成熟性及功能的變化,以便為同時(shí)應(yīng)用IDO及imDCs來誘導(dǎo)氣道的免疫耐受防治過敏性哮喘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 含小鼠IDO基因的pEGFPN1-IDO重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;rmGM-CSF、rmTNF-α及 rmIL-4（Peprotech公司）;脂質(zhì)體 DOTAP（Roche 公司）;FITC-MHC Ⅱ、FITC-CD80、FITC-CD86、PE-CD11c單克隆抗體（eBioscience公司）;抗IDO抗體（SantaCruz公司）;Western blot試劑盒、淋巴細(xì)胞分離液及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（北京鼎國公司）。

1.2 小鼠骨髓來源imDCs的分離、培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行,頸椎脫臼法處死BALB/c小鼠,用皮試針抽吸 RPMI1640培養(yǎng)液沖洗髓腔,獲得細(xì)胞懸液,2 500 r/min×25分鐘離心,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106m l-1,接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,內(nèi)含rmGM-CSF（10 ng/m l）及 rm IL-4（10 ng/ml）,37℃、5%CO2培養(yǎng),以后隔天半量換液,共培養(yǎng)6～8天,去除懸浮細(xì)胞,輕輕吹打,收集殘余貼壁細(xì)胞即為imDCs。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定 （1）掃描電鏡觀察:收集培養(yǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106m l-1,PBS漂洗、甩干,2.5%戊二醛固定,掃描電鏡觀察并拍照。（2）透射電鏡觀察:收集約1×107個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞離心,加入2.5%戊二醛固定液,1小時(shí)后棄去戊二醛,1%鋨酸固定,常規(guī)脫水、包埋、切片,鈾鉛雙染色,透射電鏡觀察并拍照。（3）細(xì)胞表型鑒定:收集培養(yǎng)的0.5×106～1×106細(xì)胞重懸于100μl PBS,每管加入PE-CD11c抗體0.5μl,再分別加入FITC-MHCⅡ、FITC-CD80、FITC-CD86各0.5μl,設(shè)空白對照管,4℃放置30分鐘,然后加入PBS,2 000 r/min洗滌3次,重懸于0.4m l PBS中,上機(jī)分析,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的表達(dá)。

1.4 細(xì)胞處理及分組 將imDCs分為 IDO+-imDC組、IDO--imDC組、imDC組及 mDC組。IDO+-imDC組:用pEGFP-N1-IDO重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的imDCs,方法如下:將pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒-HBS混合液50μl（含重組質(zhì)粒5μg）與100μl DOTAP脂質(zhì)體-HBS（含30μl DOTAP脂質(zhì)體）混勻,加入2m l無血清的RPM I1640培養(yǎng)基中,再加入imDCs生長（70%融合）的培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2培養(yǎng)8小時(shí),更換含10%小牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后,用G418選擇性培養(yǎng)基篩選;IDO--imDC組:用脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染;mDC 組:加入TNF-α50μg/L繼續(xù)培養(yǎng)3天;對照組:細(xì)胞不作特殊處理。

1.5 各組細(xì)胞表型鑒定 取IDO+-imDC組、imDC組及mDC組行細(xì)胞表型鑒定,方法同1.3。

1.6 Western blot檢測IDO蛋白表達(dá) 將轉(zhuǎn)染組細(xì)胞裂解,提取蛋白,按Western blot檢測試劑盒說明書操作進(jìn)行。一抗為兔抗小鼠IDO抗體,二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體。

1.7 OVA致敏小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的分離 OVA致敏小鼠模型的建立:BALB/c小鼠分別于第0、5、10天腹腔內(nèi)注射抗原混懸液1 ml（含OVA 1mg、氫氧化鋁 200μg）致敏,第 24、25、26天鼻腔內(nèi)滴入OVA抗原100μg激發(fā)。無菌條件下制備致敏小鼠脾細(xì)胞懸液,參照小鼠CD4+T細(xì)胞分離柱說明書進(jìn)行CD4+T細(xì)胞分離。

1.8 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR） 無菌條件下制備BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞懸液,用尼龍毛法獲得T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,刺激細(xì)胞分別為imDC、IDO+-imDC、IDO-imDC及 imDC,另取BALB/c小鼠T淋巴細(xì)胞為對照組上述五組細(xì)胞均經(jīng)絲裂霉素C滅活,將效應(yīng)細(xì)胞分別與各組刺激細(xì)胞以10∶1比例混合培養(yǎng)于96孔板,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)96小時(shí),加入3H-TdR 37 kBq,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),收集細(xì)胞,β-液閃計(jì)數(shù)儀檢測每分閃爍計(jì)數(shù)（cpm）值,各組結(jié)果以3孔均值表示。計(jì)算各組刺激指數(shù)（SI）=實(shí)驗(yàn)組CPM均值/對照組CPM值。

2 結(jié)果

2.1 imDCs形態(tài)學(xué)觀察及表面分子表達(dá) 培養(yǎng)24小時(shí)后見細(xì)胞開始貼壁,4天后懸浮細(xì)胞增多,呈簇狀生長,有毛刺狀突起。掃描電鏡觀察顯示,未成熟DC表面多皺褶,有大量的不規(guī)則突起,透射電鏡觀察顯示DC內(nèi)出現(xiàn)大量吞噬小泡,見圖1。符合imDCs形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果示CD11c高表達(dá)（72.1%）,CD80（8.5%）、CD86（7.5%）及MHCⅡ（10.2%）呈低水平表達(dá),符合imDCs型特征。

2.2 IDO蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染組可見一相對分子質(zhì)量約為42 kD的條帶,免疫印跡證實(shí)為IDO蛋白,而空質(zhì)粒組及對照組未見目的條帶,提示pEGFP-N1-IDO重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染imDCs后,imDCs能表達(dá)IDO蛋白,見圖2。

圖1 imDCs形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphology and m icrostructure of immature DC

圖2 各組IDO蛋白表達(dá)Fig.2 IDO p rotein expression detected by Western b lot in each group

表1 各組DCs表面分子表達(dá)率比較（%,±s）Tab.1 Compared the expression of surfacemolecules of DCs in each group（%,±s）

表1 各組DCs表面分子表達(dá)率比較（%,±s）Tab.1 Compared the expression of surfacemolecules of DCs in each group（%,±s）

Noge:1）P＞0.05 vs imDC group;2）P＜0.05 vs imDC group.

Groups n CD80 CD86 MHCⅡimDC group 3 8.5±1.8 7.5±1.6 10.2±2.1 IDO+-imDC group 3 9.4±2.21） 8.7±1.11） 11.4±2.61）mDC group 3 65.2±8.92）72.1±9.62） 80.5±7.82）

2.3 imDCs表型分析 IDO+-imDC組的CD11c表達(dá)為（79.5±12.6）%,CD80、CD86、MHC Ⅱ仍低表達(dá),分別為（9.4±2.2）%、（8.7±1.1）%、（11.4±2.6）%,與imDC組比較,兩組無顯著差異（P＞0.05）;與mDC組比較,CD80、CD86、MHCⅡ兩組表達(dá)有顯著差異（P＜0.05）,說明脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1-IDO真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對未成熟DC成熟性無影響,見表1。

2.4 MLR結(jié)果 imDC組的cpm值與對照組比較,無顯著差異（P＞0.05）,只能微弱刺激T淋巴細(xì)胞增殖;mDC組cpm值明顯增加,與對照組比較,有顯著差異（P＜0.05）,能明顯刺激T淋巴細(xì)胞增殖。IDO+-imDC組與imDC組及對照組比較cpm值及SI均明顯降低比較,有顯著差異（P＜0.05）,說明IDO基因轉(zhuǎn)染的imDC對T淋巴細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,見表2。

3 討論

DC是最有效的APC,它不僅參與抗原的攝取及提呈,誘導(dǎo)免疫反應(yīng),而且可誘導(dǎo)免疫耐受。DC駕御免疫反應(yīng)的方向和程度,目前認(rèn)為與所處的成熟狀態(tài)有關(guān),成熟樹突狀細(xì)胞（Mature dendritic cells,mDC）能刺激免疫應(yīng)答,而imDC因其表面缺乏MHCⅠ/Ⅱ類分子及低表達(dá)協(xié)同刺激分子,不能激活T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng),誘導(dǎo)免疫耐受[5]。Mahnke等[2]研究表明,imDCs通過膜上的DEC-205受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用而攝取外來抗原仍能保持其未成熟狀態(tài),并刺激初始型T細(xì)胞分化成CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+Treg）生成,誘導(dǎo)免疫耐受。同時(shí)Megan等[3]證實(shí)人外周血初始型（naive）T細(xì)胞在負(fù)載抗原的異源 imDCs刺激下也可向Tr1轉(zhuǎn)化（Treg的一種）。因此imDCs在免疫耐受中有重要的作用。

表2 各組DC在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對小鼠T細(xì)胞的刺激作用（±s）Tab.2 The effects of T cell stimulation in m ixed lymphocyte reaction induced by different groups of DCs（±s）

表2 各組DC在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對小鼠T細(xì)胞的刺激作用（±s）Tab.2 The effects of T cell stimulation in m ixed lymphocyte reaction induced by different groups of DCs（±s）

Note:1）P＜0.05 vs imDC group;2）P＜0.05 vs controlgroup;3）P＞0.05 vs controlgroup.

Groups n MLR（cpm） SI Controlgroup 3 1 290±205.4 —imDC group 3 1 199±275.53） 0.93 IDO--imDC group 3 1 238±320.6 0.96 IDO+-imDC group 3 678±90.31）2） 0.52 mDC group 3 6 560±621.2 5.05

IDO是色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶,能催化色氨酸氧化分解成犬尿酸等代謝產(chǎn)物。研究表明T細(xì)胞生長微環(huán)境中如果無外源色氨酸,被抗原提呈細(xì)胞提呈的抗原激活后,因不能合成足夠的蛋白質(zhì)而停滯于G1期,更易于經(jīng)凋亡而死亡。IDO在機(jī)體免疫豁免器官大量表達(dá),其在保護(hù)胎兒免遭母體排斥的妊娠過程、器官移植及自身免疫性疾病耐受中的作用已成為近年研究的熱點(diǎn),在過敏性哮喘中的免疫耐受中亦引起人們重視[6,7]。已有的研究表明表達(dá)IDO的DC能通過以下機(jī)制誘導(dǎo)外周免疫耐受:（1）IDO分解代謝局部微環(huán)境中的色氨酸而抑制激活T細(xì)胞分化、增殖,導(dǎo)致T細(xì)胞無能（Treg樣反應(yīng)）[8]。（2）通過IDO催化色氨酸分解代謝的產(chǎn)物,誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,從而清除活化的抗原特異性T細(xì)胞克隆[9]。同時(shí),Taher等[10]在大鼠體內(nèi)模型中證實(shí)通過IDO分解代謝色氨酸分解代謝的產(chǎn)物犬尿酸等在Th2介導(dǎo)的過敏性氣道炎癥可誘導(dǎo)免疫耐受。

過敏性哮喘患者體內(nèi)能檢測到活化的T淋巴細(xì)胞凋亡不足,可能是哮喘發(fā)病機(jī)制存在著免疫耐受機(jī)制缺陷的證據(jù)。鑒于初始型（na?ve）CD4+T細(xì)胞激活是其發(fā)病的始動(dòng)因素,而且CD4+T細(xì)胞在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,因此我們設(shè)想通過應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)IDO修飾imDCs移入動(dòng)物模型氣道,imDCs在提呈抗原激活記憶性CD4+T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)IDO,抑制活化的CD4+T細(xì)胞增殖,將可能誘導(dǎo)氣道抗原特異性T細(xì)胞耐受,起到防治哮喘作用。欲達(dá)到上述目的,首先要將IDO基因轉(zhuǎn)染到imDCs分泌表達(dá)IDO,同時(shí)不能改變其未成熟特性。目前最常用的腺病毒載體,本身有激活imDCs的可能[11]。

與腺病毒載體相比,脂質(zhì)體載體本身對細(xì)胞無毒性。本項(xiàng)目用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將IDO基因轉(zhuǎn)染大鼠imDCs,觀察到DC仍保持未成熟狀態(tài),與王永權(quán)等[12]的結(jié)論一致,避免了常用的腺病毒載體對imDCs成熟性的影響。同時(shí)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中,轉(zhuǎn)染了IDO基因的imDCs能明顯地抑制T細(xì)胞的增殖,推測機(jī)制可能除了imDCS誘導(dǎo)的免疫抑制作用外,同時(shí)imDCs分泌表達(dá)的IDO分解代謝色氨酸,從而抑制了T細(xì)胞活化并誘導(dǎo)其凋亡有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)為我們同時(shí)應(yīng)用IDO及imDCs誘導(dǎo)氣道免疫耐受來防治過敏性哮喘提供了依據(jù)。但如何在體內(nèi)避免其他炎性因子及抗原對 imDCs成熟性的影響,保持imDCs未成熟狀態(tài),起到imDCs與IDO的雙重誘導(dǎo)氣道免疫耐受作用來防治過敏性哮喘還有待繼續(xù)深入研究。

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[收稿2010-05-27 修回2010-07-19]

（編輯 張曉舟）

Thematuration characteristics and function of immature dendritic cells transfected by liposome-mediated indoleam ine 2,3-dioxygenase（IDO）gene

LIAOWei,ANXiao-Jing,QIANGui-Sheng,ZHAOCong-Min.DepartmentofPediatricsXinqiaoHospital,ThirdMilitary MedicalUniversity,Chongqing400037,China

Objective:To investigate the influence of indoleam ine 2,3-dioxygenase（IDO）genemediated by liposome transfection on function of immature dendritic cells（imDCs）.Methods:ImDCswere cultured from bonemarrow of BALB/cmouse.The cellswere identified by transmission electronm icroscope,scanning electronmicroscope,and flow cytometry.Then the imDCswere divided intoIDO+-imDC group（imDCs transfectedwith recombinant pEGFP-N1-IDO expression vector）,IDO--imDC group（imDCswere transfected with recombinant pEGFP-N1 vector）,control group（imDCswithout special processing）andm DC group（（imDCs inducedwith TNF-α）.IDO protein expression in each group was detected byWestern blot;The expression of cellmarkerwas determined with flow cytometry.Their ability to stimulate antigen-specificity T lymphocyte proliferation was determined with allogeneticmixed leukocyte reaction in each groups.Results:The cultured imDCs of BALB/c mouse bonemarrow exhibited typial characteristics of surfacemarkers and cellmorphology consistentwith imDCs;IDO protein exp ression was seen in transfection group.The expression rate of CD80,CD86,MHCⅡ was（9.4±2.2）%,（8.7±1.1）%and（11.4±2.6）%,respectively,whichwas exhibited no difference compared with those in imDC group（8.5±1.8）%,（7.5±1.6）%and（10.2±2.1）%,respectively,P＞0.01.The ability of IDO+-imDCgroup to stimulate antigen-specificity T lymphocyte p roliferation in vitrowas distinctly lower than in imDC group（678±90.3vs1 199±275.5,P＜0.01）.Conclusion:ImDCs transfected by liposome-mediated IDO gene remain their immature state and can inhibit the proliferation of the T lymphocytes.

Indoleamine2,3-dioxygenase;Dend ritic cells;Liposomes;Transfection

R392.9

A

1000-484X（2010）12-1069-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.003

①本文受國家自然科學(xué)基金資助（No.30500231）

②第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍呼吸研究所,重慶400037

廖 偉（1971年-）,男,博士,副教授,副主任醫(yī)師,主要從事哮喘發(fā)病的免疫機(jī)制研究,E-mail:liaowei01@163.com;

及指導(dǎo)教師:錢桂生（1954年-）,男,教授,主任醫(yī)師,主要從事呼吸窘迫綜合征發(fā)病機(jī)制研究,E-mail:qianguisheng@163.com。