于洋，黃紹輝，劉敏達，王緒凱

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科教研室，口腔頜面頭頸外科，沈陽 110002）

面神經(jīng)損傷后MnTBAP對面神經(jīng)元的保護作用

于洋，黃紹輝，劉敏達，王緒凱

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科教研室，口腔頜面頭頸外科，沈陽 110002）

目的 觀察錳苯甲酸卟啉（MnTBAP）對大鼠面神經(jīng)擠壓傷后神經(jīng)元的保護作用及對caspase-3表達的影響。方法 制作大鼠雙側(cè)面神經(jīng)總干擠壓傷模型，左側(cè)損傷局部給予MnTBAP，右側(cè)給予生理鹽水作為對照。于傷后1，3，7，14，28，42d時，觀察大鼠面癱恢復(fù)情況；HE染色觀測術(shù)后面神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化；免疫組化檢測caspase-3表達的變化。結(jié)果 MnTBAP對總干擠壓傷后的面神經(jīng)有明顯的功能恢復(fù)作用；傷后第3日開始，MnTBAP側(cè)和對照側(cè)面神經(jīng)元存活率逐漸下降，第7日開始，MnTBAP側(cè)面神經(jīng)元存活率明顯高于對照側(cè)（P<0.05）；傷后第3日，caspase-3表達增加，第14日時達高峰，各時間點表達水平MnTBAP側(cè)低于對照側(cè)（P<0.05）。結(jié)論 MnTBAP有助于擠壓傷后面神經(jīng)功能恢復(fù)，降低caspase-3的表達、抑制細胞凋亡可能是MnTBAP治療創(chuàng)傷性面癱的重要機制之一。

面神經(jīng)元；錳苯甲酸卟啉；凋亡

外傷性面神經(jīng)損傷是面癱發(fā)病的重要原因［1］，占面癱發(fā)病率的17%［2］。目前，臨床常采用的顯微外科技術(shù)雖可較好的恢復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性，但神經(jīng)功能的恢復(fù)仍不令人滿意。錳苯甲酸卟啉［Mn（Ⅲ）tetrakis（4-benzoic acid）porphyrin chloride，MnTBAP］分子式為C48H28ClMnN4O8，是含有金屬錳的卟啉藥物，是超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）類似物和廣譜的游離基清除劑，它本身同時具有SOD和過氧化氫酶（catalase，CAT）的特性，且具有無毒、穩(wěn)定、細胞膜通透性佳的特性［3］。目前MnTBAP主要應(yīng)用于腦和脊髓神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療，而將其用于面神經(jīng)損傷治療的研究尚未見報道。本研究旨在觀察大鼠面神經(jīng)損傷后對其神經(jīng)元的存活和caspase-3蛋白表達的影響，探討MnTBAP對創(chuàng)傷性面癱的神經(jīng)保護作用及可能機制，以期為外周神經(jīng)損傷提供新的藥物治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠40只（中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供），體質(zhì)量250～300g，雌雄不限，隨機分為術(shù)后飼養(yǎng) 1、3、7、14、28和 42d 6個組，每組各 5只動物，每只動物為自身對照。另外10只大鼠作為假手術(shù)組。原位末端標記（TUNEL）凋亡檢測試劑盒、caspase-3一抗（多克隆抗體）、即用型SABC試劑盒（包括正常封閉血清、生物素化二抗、SABC、抗原修復(fù)液）及DAB染色液均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。MnTBAP由美國Calbiochem公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備：水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射麻醉動物。解剖分離兩側(cè)的面神經(jīng)總干，在雙側(cè)莖乳孔用特定蚊式鉗三扣結(jié)鉗夾面神經(jīng)總干（長約2mm）同一部位2次，每次30s，間隔15s。MnTBAP治療組：在左側(cè)神經(jīng)近心端斷端處置浸滿MnTBAP（4mg/kg），約3mm×3mm×3mm 大小的醫(yī)用膠原蛋白海綿塊；在右側(cè)面神經(jīng)近心端斷端處置同樣大小浸滿生理鹽水的膠原蛋白海綿塊做為對照組。假手術(shù)組：僅暴露雙側(cè)面神經(jīng)總干而不損傷神經(jīng)，縫合皮膚。各組大鼠標記后分籠飼養(yǎng)。自手術(shù)后開始至灌注前，每日觀察動物觸須節(jié)律性拂動及眨眼反射的恢復(fù)情況。

1.2.2 取材和切片：實驗動物在預(yù)定時間行大體觀察后，再次用水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射麻醉，采用經(jīng)左心室插管，升主動脈快速灌注生理鹽水150～200ml，用4℃、4%多聚甲醛350ml灌注固定，開顱取腦干，以小腦橋延溝為中心，左右水平切取約2mm厚的腦組織塊，放置于4%的多聚甲醛中進行后固定。常規(guī)石蠟包埋，依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［4］定位面神經(jīng)核橫斷面，5μm連續(xù)切片，每間隔5張取1張切片，共收集4套切片，每套均為3張切片，分別用于HE染色、caspase-3免疫組化及TUNEL凋亡檢測。

1.2.3 面神經(jīng)元的記數(shù)方法：面神經(jīng)元胞體直徑約20～25μm，尼氏體染色均勻者，或胞核、核仁明顯位于胞體中央者均在記數(shù)范圍內(nèi)。面神經(jīng)核團內(nèi)神經(jīng)元（facial motoneurons，F(xiàn)MNs）計數(shù)在 Olympus顯微鏡下（×200）進行。每只動物隨機取4張切片計算左右兩側(cè)面神經(jīng)核團中運動神經(jīng)元的數(shù)目，分別得出左右兩側(cè)運動神經(jīng)元數(shù)目與假手術(shù)組運動神經(jīng)元數(shù)目之比，為該側(cè)運動神經(jīng)元存活百分率。

1.2.4 TUNEL凋亡檢測：采用原位末端標記法，按照試劑盒說明書操作，陽性結(jié)果以細胞核被染成棕黃色為準。每只動物隨機取4張切片，每張切片面神經(jīng)核計數(shù)5個高倍鏡視野（×200），取平均值，為該切片凋亡細胞數(shù)。

1.2.5 caspase-3免疫組化檢測：每只動物隨機取4張切片，按SABC法進行免疫組化染色，滴加一抗（1∶100比例稀釋），DAB染色，按照說明書步驟操作。陽性結(jié)果以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色為準。顯微鏡下觀察，每張切片觀察計數(shù)5個視野（×200），取平均值，為該片的陽性細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

正常情況下，大鼠觸須向前豎起并有節(jié)律性地拂動，能完全閉眼。面神經(jīng)損傷后所有動物進食、活動正常。傷后1d雙側(cè)觸須集中伸直并向后伸展呈倒伏狀，完全不能拂動，無閉眼動作，呈現(xiàn)完全性面癱。傷后7d MnTBAP治療組觸須仍倒伏，輕微拂動，有上瞼輕微閉眼動作；傷后14d，觸須向前恢復(fù)豎起，有節(jié)律性地拂動，動度和速度接近正常，能完全閉眼，面癱癥狀基本恢復(fù)。傷后14d對照組觸須仍倒伏，輕微拂動，無閉眼動作；傷后28d觸須回到正常位置，拂動基本與對側(cè)一致，能完全閉眼，面癱癥狀基本完全恢復(fù)。

2.2 光鏡觀察

正常面神經(jīng)核團中神經(jīng)元透亮、光滑、無皺縮。胞體直徑約20～25μm，胞核居中，HE染色后呈深紫色，核仁淡紫色，位于胞體中央，胞質(zhì)中尼氏小體染色均勻為淡紫色，軸突明顯。傷后第1日時，可見MnTBAP治療組大鼠面神經(jīng)元大部分細胞仍保持正常形態(tài)，對照組神經(jīng)元在光鏡下胞體縮小變圓，不規(guī)則，胞質(zhì)濃縮，染色加深，胞核皺縮變小，軸突不明顯但胞膜完整，偶見胞體腫脹變圓。從傷后第3日開始MnTBAP治療組和對照組面神經(jīng)元存活率逐漸下降，傷后第28日存活率達到最低，傷后第42日與28日比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各時間點MnTBAP治療組和對照組面神經(jīng)元存活率變化一致，但從第7日開始MnTBAP治療組面神經(jīng)元存活率明顯高于對照組（P<0.05）（表1）。

2.3 TUNEL染色檢測

TUNEL陽性細胞核被染成棕黃色，假手術(shù)組、對照組和MnTBAP治療組損傷后第1、3日均未見陽性表達，第7日開始MnTBAP治療組和對照組可見TUNEL陽性表達，于第14日達到高峰，陽性細胞最多，隨后陽性細胞數(shù)量減少，傷后28d、42d時可見少量陽性細胞表達。MnTBAP治療組和對照組比較，TUNEL陽性表達時間變化一致，但各時間點表達水平 MnTBAP治療組較對照組低（P<0.05）（圖 1，2）。

表1面神經(jīng)損傷后不同時間點面運動神經(jīng)元的存活率（±s，%）Ta b.1Su r v i v a l r a t e o f f a c i a l n e u r o n s a t d i f f e r e n t p o i n t s a f t e r f a c i a l n e r v e i n j u r y（±s，%）Time after facial nerve injury Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 Day 28 Day 42MnTBAP-treated 84.49±1.01 83.33±1.75 68.71±1.021） 62.28±2.321） 56.43±0.511） 65.79±2.321）Sham-operated 84.79±1.37 81.58±2.32 62.86±1.83 53.80±1.34 42.69±1.01 52.92±1.34Group 1）P<0.05vs sham-operated group.

2.4 caspase-3免疫組化檢測

結(jié)果如表2及圖3所示：（1）假手術(shù)組面神經(jīng)核未見 caspase-3陽性表達；（2）傷后第 3日時，caspase-3表達水平開始升高，于第14日時達到高峰，第28日表達水平下降，傷后第42日時僅可見少量陽性表達。MnTBAP治療組和對照組caspase-3陽性表達時間變化一致，但各時間點表達水平MnTBAP組較對照組低（P<0.05）。

表2Mn TBAP對損傷后面神經(jīng)元內(nèi)c a s p a s e-3的影響（±s）Ta b.2Ef f e c t o f Mn TBAPo n c a s p a s e-3e x p r e s s i o n i n f a c i a l n e u r o n s a f t e r f a c i a l n e r v e i n j u r y（±s）Time after facial nerve injury Day 3 Day 7 Day 14 Day 28 Day 42MnTBAP-treated 4.25±1.501） 49.25±4.921） 79.75±3.771） 28.25±2.751） 21.50±2.521）Sham-operated 10.50±3.87 67.00±5.48 93.50±3.87 36.25±3.86 27.25±3.10Group 1）P<0.05vs sham-operated group.

3 討論

3.1 面神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的改變

面神經(jīng)損傷后，其胞體從靶器官獲取的神經(jīng)營養(yǎng)因子減少，出現(xiàn)形態(tài)改變，并不可避免地引起一定數(shù)量的神經(jīng)元死亡［5，6］。有證據(jù)表明［7，8］，大鼠面神經(jīng)擠壓傷后50%的神經(jīng)元發(fā)生死亡，損傷后神經(jīng)元死亡是一個復(fù)雜的過程，死亡形式包括壞死和凋亡兩種方式。其中凋亡作為一個可調(diào)控的細胞死亡過程，是周圍神經(jīng)損傷后中樞神經(jīng)元死亡的主要原因［9］。本研究結(jié)果顯示，面神經(jīng)損傷后，其神經(jīng)元胞體縮小、胞質(zhì)濃縮，軸突不明顯，但胞膜完整，其形態(tài)學(xué)改變符合凋亡細胞的表現(xiàn)，且神經(jīng)元數(shù)目明顯少于假手術(shù)組（P<0.05），同時神經(jīng)元存活率隨時間延長逐漸降低，傷后第28日面神經(jīng)元存活率達到最低，提示面神經(jīng)損傷后可發(fā)生面神經(jīng)元凋亡，這與以往學(xué)者的研究結(jié)果一致。

3.2 MnTBAP對面神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的保護作用

神經(jīng)元凋亡是神經(jīng)損傷最主要的表現(xiàn)之一，長久以來對其研究的重點都集中在給與神經(jīng)營養(yǎng)因子，抗凋亡以及減少自由基產(chǎn)生等治療策略，這些策略的共同點都是直接圍繞著如何抑制神經(jīng)元細胞凋亡而設(shè)計的。凋亡的發(fā)生是一個復(fù)雜的、由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程。caspase-3在蛋白酶級聯(lián)切割過程中處于核心位置，不同的蛋白酶分別切割caspase-3酶原，從而激活caspase-3，活化的caspase-3又進一步分割不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)切割效應(yīng)放大，最終使細胞走向死亡［10～12］。我們的結(jié)果顯示，面神經(jīng)擠壓傷后3d時，面神經(jīng)元中caspase-3蛋白表達增強，并于術(shù)后14d達到高峰。表明caspase-3作為caspase系統(tǒng)的最終效應(yīng)酶而參與凋亡。

本研究采用MnTBAP作用于損傷后的大鼠面神經(jīng)，以探討其對創(chuàng)傷性面癱的神經(jīng)保護作用及可能機制。有文獻報道，MnTBAP藥物本身具有廣譜游離基清除作用外，在減少細胞凋亡方面也具有重要作用。Lee等［13］發(fā)現(xiàn)小鼠局灶性腦缺血損傷后，MnTBAP對超氧游離基具有明顯的清除作用，且能夠明顯減少神經(jīng)細胞凋亡和DNA損傷；Aladag［14］發(fā)現(xiàn)MnTBAP能減少腦血管痙攣后超氧游離基的產(chǎn)生和細胞凋亡。Day等［15］發(fā)現(xiàn)MnTBAP具有明顯減少脊髓損傷后產(chǎn)生的羥基游離基（-OH）的氧化損傷和細胞凋亡作用。

本研究結(jié)果表明，局部應(yīng)用MnTBAP后，傷后第7日開始，MnTBAP治療組大鼠面神經(jīng)元存活率明顯高于對照組（P<0.05），說明MnTBAP能夠減少面神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的死亡數(shù)量，并對面神經(jīng)元凋亡有明顯抑制作用。同時免疫組織化學(xué)結(jié)果證明，面神經(jīng)損傷后，盡管MnTBAP治療組與對照組caspase-3蛋白表達水平均出現(xiàn)先升高再下降，但其表達水平較對照組顯著降低（P<0.05），進一步說明MnTBAP可能通過抑制caspase-3的表達，抑制面神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述，我們初步證實了外源性的MnTBAP是一種有效的神經(jīng)保護劑，損傷后早期給藥將有助于抑制面神經(jīng)元的凋亡。但MnTBAP在外周神經(jīng)損傷中的保護和促進神經(jīng)再生的具體作用機制還有待進一步的研究。

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（編輯 王又冬，英文編輯 陳 姜）

Neuroprotective Effect of MnTBAPon Facial Neurons after Facial Nerve Injury in Rats

YUYang，HUANGShao-hui，LIUMin-da，WANGXu-kai
（Division of Oral and Maxillofacial-Head and Neck Surgery，Department of Oral and Maxillofacial Surgery，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo observe the neuroprotective effect of MnTBAPafter facial nerve crush and the effect of MnTBAPon the expression of caspase-3in rats.MethodsFacial nerve injury model was established by crushing bilateral facial nerves of 40SDrats，and then the left and right facial nerves were treated with MnTBAP（MnTBAP-treated group）and normal saline（sham-operated group），respectively.On days 1，3，7，14，28，and 42after the facial nerve injury，the recovery of facial paralysis was observed；the morphology of facial neurons was observed under light microscope；and the expression of caspase-3was detected by immunohistochemistry.ResultsThe faical nerve in MnTBAP-treated group showed obvious recovery of function after facial nerve crush.The survival rates of facial neurons in both groups decreased gradually since day 3，and the survival rate of facial neurons in MnTBAP-treated group was significantly higher than that in shamoperated group since day 7.The expression of caspase-3increased since day 3and reached the peak on day 14.The expression level of caspase-3in MnTBAP-treated group was significantly lower than that in sham-operated group at each time point.ConclusionMnTBAPcould promote the recovery of function after facial nerve crush.Inhibiting the apoptosis and decreasing the expression of caspase-3may be involved in the mechanism of the treatment of traumatic facial paralysis by MnTBAP.

facial neuron；MnTBAP；apoptosis

R782.4

A

0258-4646（2010）11-0915-04

沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃項目（200340）

于洋（1983-），女，碩士研究生.

黃紹輝，E-mail：huangshaohui@hotmail.com

2010-06-24