陳啟光，馬東蔚，張哲，單廣夷，孔垂?jié)?/p>

（中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院1.泌尿外科；2.內分泌科，沈陽 110001）

鋅對前列腺癌22RV1細胞的增殖及ZIP4mRNA表達的影響

陳啟光1，馬東蔚2，張哲1，單廣夷1，孔垂?jié)?

（中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院1.泌尿外科；2.內分泌科，沈陽 110001）

目的 探討鋅對前列腺癌22RV1細胞的增殖及對ZIP4mRNA表達的影響。方法 采用倒置相差顯微鏡觀察并采用MTT法檢測不同濃度鋅（0.5、5、50、100μmol/L）對前列腺癌22RV1細胞的形態(tài)及增殖活性的影響，實時定量RT-PCR法檢測不同濃度鋅在不同時間點對ZIP4mRNA表達的影響。結果 在鋅濃度為0.5μmol/L時，細胞皺縮，形態(tài)發(fā)生明顯變化，增殖活性下降，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其余3組未見明顯變化（P＞0.05）。隨著鋅作用時間的延長，ZIP4mRNA表達量下降，36h達最低值之后保持恒定；當鋅濃度為0.5μmol/L時，ZIP4mRNA的表達量變化與對照組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各濃度組變化均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。結論 鋅在一定濃度水平上可以抑制前列腺癌22RV1細胞的增殖活性，且對ZIP4mRNA的表達具有時間和劑量依賴性。

鋅；前列腺癌；22RV1；增殖；ZIP4

鋅是人體必須的微量營養(yǎng)元素之一，是體內200多種含有鋅指結構的酶和轉錄因子保持活性并參與細胞結構組成和催化活性的必要組成部分［1，2］。與鋅相關的某些酶在缺氧、血管生成、細胞增殖和腫瘤轉移中扮有重要角色。研究表明，與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織中鋅濃度下降達62%～75%［3，4］，前列腺的外周帶具有高度特異性的腺分泌上皮細胞能聚集高濃度的鋅離子，是前列腺癌的好發(fā)部位，因而推測鋅在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。鋅鐵調控蛋白（ZRT，IRT-like protein，ZIP）家族是新近發(fā)現(xiàn)的一類金屬離子轉運體，其主要功能是將鋅離子轉入細胞內，與鋅轉運體（zinc transporter，ZnT）家族共同作用維持細胞內鋅離子的穩(wěn)定，ZIP4是ZIP家族的一員，在鋅離子的吸收轉運中起重要作用［5］。本研究以不同濃度的鋅離子作用于前列腺癌22RV1細胞，觀察其對細胞增殖活性及對細胞內ZIP4mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司），胎牛血清（TBD公司），TRIZOL（Invitrogen公司），SYBR誖PrimeScriptTMRT-PCRKit II（Perfect Real Time）（Takara公司），引物由大連寶生物工程有限公司設計合成，ZnCl2購自國藥集團（分析純試劑）。紫外分光光度計（美國Thermo公司），ROTOR-GENE6000離心式熒光定量PCR儀（澳大利亞Corbett公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)前列腺癌22RV1細胞，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的孵箱內，隔日換液，用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液隔日消化、傳代。

1.3 MTT法檢測細胞增殖能力

取對數(shù)生長期細胞，以每孔3×103個細胞接種于96孔板內，待細胞完全貼壁后，分別加入終濃度為 0.5μmol/L、5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的ZnCl2，每孔終體積為 200μl，每個濃度設 5個平行孔，同時設調零孔和對照孔，周邊孔用PBS填充，置37℃、5%CO2孵箱中，分別于 12h，24h，36h，48h，60h終止培養(yǎng)，每孔加入新鮮配制的MTT溶液（5mg/ml），于37℃繼續(xù)孵育4h后棄孔中培養(yǎng)液，加入150μl DMSO（二甲基亞砜），避光低速振蕩10min，于酶標儀上波長490nm處測定各孔吸光度值（A值）。

1.4 總RNA提取及cDNA的合成

不同濃度 ZnCl2作用 12h，24h，36h及 48h后，按5×106～1×107個細胞加1ml TRIZOL低溫吹打；按說明書提取總RNA。用DEPC處理的超純水溶解RNA，60℃孵育5min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，分光光度計測定其260nm吸光度和濃度。cDNA合成的反應體系：（1）5×PrimeScriptTMbuffer（for Real Time）4μl；（2）PrimeScriptTMRTenzyme mix I1μl；（3）Oligo dTprimer（50μmol/L）1μl；（4）Random 6mers（100μmol/L）1μl；（5）total RNA1μg；（6）加 RNase free dH2O至 20μl反應體系。反轉錄反應條件：37℃，15min；85℃，15s反轉錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實時定量PCR

采用SYBRGreen嵌合熒光進行反應，按說明書配制 12.5μl的反應體系：（1）SYBR誖Premix Ex TaqTMII（2×）6.25μl；（2）PCRforward primer（10μmol/L）0.5μl；（3）PCRreverse primer（10μmol/L）0.5μl；（4）模板（cDNA溶液）1μl；（5）dH2O4.25μl。陰性對照組加入未反轉錄的RNA作為模板。引物序列：ZIP4上游：5′ATGTCAGGAGCGGGTCTTGC3′；下游：5′GCTGCTGTGCTGCTGGAAC3′。β-actin上游：5′TGGCACCCAGCACAATGAA3′；下游：5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA3′。反應條件如下：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火 20s，72℃延伸30s同時獲取熒光，共40個循環(huán)，行產(chǎn)物的溶解曲線分析。

1.6 Comparative Delta-delta Ct法行相對定量分析

首先選前列腺癌細胞株22RV1標本作為校正組，然后對樣品中的目的基因DD3與管家基因βactin分別連續(xù)10倍稀釋后做標準曲線，通過標準曲線確定兩個基因的擴增效率是否一致或接近；將擴增效率優(yōu)化為一致，然后對目的基因和內參分別進行擴增。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度Zn2+對22RV1細胞形態(tài)的影響

分別于不同的時間點在倒置相差顯微鏡下觀察不同濃度Zn2+對前列腺癌22RV1細胞形態(tài)的影響，在鋅離子濃度為0.5μmol/L時可明顯觀察到22RV1細胞突起消失，細胞皺縮變圓，部分細胞懸浮，而在其余 3個濃度（5μmol/L、50μmol/L和 100μmol/L）時細胞形態(tài)未見明顯變化。見圖1。

2.2 不同濃度鋅對22RV1增殖活性的影響

分別于不同的時間點采用MTT法檢測不同濃度鋅離子對細胞增殖活性的影響，結果顯示，在鋅離子濃度為0.5μmol/L時，細胞的增殖活性明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其余3組與對照組相比，Zn2+對細胞增殖活性的影響無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖2。

2.3 鋅對22RV1細胞ZIP4mRNA表達的時間效應

實時定量RT-PCR法分別檢測不同濃度鋅離子在各個時間點對22RV1細胞ZIP4mRNA表達的影響。結果顯示，隨著鋅作用時間的延長，ZIP4表達量呈下降趨勢。在鋅濃度為50μmol/L時，相對于對照組在 12h，24h，36h，48h，72h 時ZIP4mRNA表達量變化分別為 0.98±0.05，0.66±0.04，0.46±0.02，0.44±0.02，0.45±0.02。在 12h 時ZIP4mRNA表達量未見明顯變化（P＞0.05），36h時ZIP4mRNA下降達到最低值，之后恒定保持在較低水平，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

2.4 鋅對22RV1細胞ZIP4mRNA表達的劑量效應

實時定量RT-PCR法檢測了不同濃度鋅離子對22RV1細胞作用36h后ZIP4mRNA表達量的變化。結果顯示，ZIP4mRNA的表達水平隨鋅離子濃度的上升而下降，與對照組相比，在鋅離子濃度為0.5μmol/L，5μmol/L，50μmol/L和 100μmol/L時ZIP4mRNA的表達量分別為 0.95±0.03，0.74±0.03，0.46±0.02，0.29±0.07。與對照組相比，鋅濃度為 0.5μmol/L時，ZIP4mRNA的表達量變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組變化均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖 4。

3 討論

鋅是很多細胞和組織必須的微量元素，正常前列腺組織中的鋅含量是其他組織的3～10倍［6］，其聚鋅能力主要由前列腺外周帶高度特異性的腺分泌上皮細胞完成，F(xiàn)ranklin等［7］將這些細胞稱為“聚鋅細胞”。Habib等［8］的研究表明，在前列腺癌發(fā)生的早期階段，腺體中的鋅濃度便開始下降，“聚鋅細胞”的聚鋅能力開始喪失，提示鋅在前列腺癌的形成階段即開始起作用。鋅鐵調控蛋白ZIP與許多惡性腫瘤的進展有關，它在乳腺癌和胰腺癌進展中的作用已經(jīng)得到部分證實［9，10］。Desouki等［11］認為，在前列腺癌中ZIP1、ZIP2和ZIP3均表達下調的同時伴鋅水平下降，表明ZIP1、ZIP2和ZIP3可能是一組抑癌基因。ZIP4是由SLC39A4基因所編碼的一種鋅鐵調控蛋白，在胃腸道上皮中呈高表達，可通過促進食物中的鋅進入腸道上皮細胞和囊泡中鋅的釋放而維持細胞內鋅的水平［1，12］。研究顯示，ZIP4的表達缺失與肌皮炎相關，其過表達與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關系［2，10，13］。但到目前為止，ZIP4在前列腺癌中的表達及其生物學機制還不是很清楚。

本研究首次在細胞水平探討了鋅對前列腺癌22RV1細胞形態(tài)及細胞內ZIP4mRNA表達的影響。結果表明，在鋅離子濃度為0.5μmol/L時，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞增殖活性明顯下降，而其他相對較高鋅濃度時卻未觀察到此現(xiàn)象。因而我們推測其可能機制是：（1）鋅離子在一定濃度范圍內變化時，細胞對自身鋅離子穩(wěn)態(tài)監(jiān)測未啟動，導致細胞內鋅離子濃度不斷增加，產(chǎn)生細胞毒性抑制細胞增殖或直接導致細胞死亡；（2）通過抑制細胞周期的某一階段或通過某種機制啟動凋亡信號通路而使細胞增殖活性下降凋亡增加，對此作用機制的推測我們會通過后續(xù)研究進一步探討。同時，本研究應用熒光定量RT-PCR法檢測了不同時間不同濃度鋅對ZIP4mRNA表達的影響，結果顯示，隨時間的增加，ZIP4mRNA表達隨之降低，36h時降至最低值；而且隨著鋅濃度的增加，ZIP4mRNA的表達量亦隨之下降。結果提示，前列腺癌22RV1細胞中ZIP4mRNA的表達量受外環(huán)境中鋅的調控，并具有時間和劑量效應。在高鋅狀態(tài)下，細胞可通過減少ZIP4mRNA的表達來維持細胞內鋅的穩(wěn)態(tài)，而保持細胞特性。

綜上所述，在一定的濃度水平，鋅離子可以抑制前列腺癌細胞的增殖活性。同時在不同時間不同濃度鋅離子作用下，ZIP4mRNA的表達具有時間和劑量效應，其在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起何種作用，與其他鋅轉運體如何相互作用、共同參與鋅穩(wěn)態(tài)的調節(jié)尚有待進一步研究。

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（編輯 王又冬，英文編輯 陳 姜）

Effect of Zinc on the Proliferation of Prostate Cancer Cell Line 22RV1and the Expression ofZIP4mRNA

CHENQi-guang1，MADong-wei2，ZHANGZhe1，SHANGuang-yi1，KONGChui-ze1
（1.Department of Urology；2.Department of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effect of zinc on the proliferation of prostate cancer cell line 22RV1and the expression ofZIP4mRNA.MethodsThe morphology of 22RV1cells exposed to different concentrations of zinc was observed under phase contrast microscope，and the proliferative activity of 22RV1cells was detected by MTTassay.The effect of different concentrations of zinc on the expression ofZIP4mRNAwas determined by real-time quantitative polymerase chain reaction at different time points.ResultsIn 22RV1cells exposed to zinc of 0.5μmol/L，obvious morphological changes were found，and the proliferative activity significantly decreased compared with control group （P＜ 0.01）.No signficant difference in the proliferative activity was found between 22RV1cells exposed to zinc of 5，50，and 100μmol/Land control group （P＞0.05）.The expression ofZIP4mRNAdecreased with the duration of zinc exposure and reached the lowest level after 36hours，and then the level ofZIP4mRNAmaintained.Compared with the control group，the expression ofZIP4mRNAsignificantly decreased in 22RV1cells exposed to zinc of 5，50，and 100μmol/L，except for the cells exposed to zinc of 0.5μmol/L.ConclusionWithin a certain range of concentration，zinc can inhibit the proliferation of prostate cancer cell line 22RV1，and has a time-and dose-dependent effect on the expression ofZIP4mRNA.

zinc；prostate cancer；22RV1；proliferation；ZIP4

R737.25

A

0258-4646（2010）11-0908-04

遼寧省科技計劃資助項目（2007225002-1，2007216010）

陳啟光（1983－），男，博士研究生.

孔垂?jié)桑珽-mail：wzhoucmu@163.com

2010-04-09