李英慧，李春義，陳芳杰，趙彥艷

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001）

曲古抑菌素A對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞NOS1基因轉(zhuǎn)錄的影響

李英慧，李春義，陳芳杰，趙彥艷

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001）

目的 以曲古抑菌素A（TSA）為乙酰化作用因素，研究大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中乙?；瘜?duì)神經(jīng)型一氧化氮合酶（NOS1）基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。方法 應(yīng)用real-time RT-PCR方法檢測(cè)C6細(xì)胞中NOS1基因mRNA在不同時(shí)間及不同濃度TSA作用下表達(dá)水平的變化；采用nuclear run-off實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TSA作用下NOS1基因轉(zhuǎn)錄效率的改變。結(jié)果 TSA以時(shí)間及濃度依賴方式上調(diào)C6細(xì)胞中NOS1mRNA水平；NOS1基因轉(zhuǎn)錄效率在TSA作用下顯著提高。結(jié)論 TSA引起的乙?；笴6細(xì)胞中NOS1基因轉(zhuǎn)錄水平明顯增加。

NOS1；TSA；乙酰化

一氧化氮（nitric oxide，NO）在神經(jīng)系統(tǒng)中具有多種不同的功能。神經(jīng)型一氧化氮合酶（NOS1）在神經(jīng)系統(tǒng)的NO合成中發(fā)揮重要作用［1］。NOS1基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)NOS1蛋白的表達(dá)及NO的合成。蛋白質(zhì)乙?；诨蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。曲古抑菌素A（TSA）是一種組蛋白去乙?；敢种苿梢鸲喾N蛋白質(zhì)的乙?；?］，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。本研究以TSA作為刺激因素，探索乙酰化對(duì)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中NOS1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

C6細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。37℃，5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.2 RNA提取及real-time RT-PCR

將細(xì)胞隨機(jī)分為2組，一組用濃度分別為0、2.5、25、250和 2500ng/ml TSA處理 24h，另一組為濃度 250ng/ml TSA分別作用 0、6、12、24及 48h，分別收集2組細(xì)胞。應(yīng)用TRIzol試劑常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司）合成cDNA。NOS1引物及Taqman探針序列：上游5′-AGGAGGACGCTGGTGTATTC-3′，下游 5′-ATCTAAGGCGGTTGGTCACT-3′，Taqman 探針：5′Fam-ACCGGTTGTCATCCCTCAGCCT-3′Tamra；同時(shí)，βactin作為內(nèi)參，應(yīng)用如下引物及探針進(jìn)行擴(kuò)增：上游 5′-AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3′，下游 5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAT-3′，Taqman 探 針 ：5′Fam-CCCTCCATCGTGCACCGCAA-Tamra 3′。PCR在優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行。采用相對(duì)定量方法，每個(gè)樣品擴(kuò)增3次，取平均值作為樣品的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 Nuclear run-off實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)照及TSA（250ng/ml）刺激24h的C6細(xì)胞，裂解細(xì)胞。獲得的細(xì)胞核重懸于甘油貯存液，并立即置于-70°C凍存待用。制備含人NOS1或βactin cDNAs的pMD18-T載體，并用Hind III酶切線性化、0.2mol/LNaOH變性，作為探針交聯(lián)于尼龍膜上。將制備好的細(xì)胞核孵育在含100μCi［α-32P］UTP的反應(yīng)緩沖液中，30°C，30min，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)混合物用DNase I及蛋白酶K處理，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀獲得RNA。合成的RNA與尼龍膜45°C雜交48h，2×SSC洗膜3次，放射自顯影。以βactin信號(hào)為內(nèi)對(duì)照，分析TSA刺激前后NOS1信號(hào)強(qiáng)弱變化。

2 結(jié)果

2.1 TSA以時(shí)間和濃度依賴方式上調(diào)C6細(xì)胞中NOS1基因mRNA表達(dá)

細(xì)胞經(jīng)不同濃度TSA作用24h，NOS1mRNA水平逐漸上升；當(dāng)細(xì)胞經(jīng)250ng/ml TSA作用不同時(shí)間，24hNOS1mRNA達(dá)到最高水平 （圖1）。因此，TSA引起的乙?；軌蛞詴r(shí)間及濃度依賴方式上調(diào)NOS1mRNA表達(dá)。

2.2 TSA使C6細(xì)胞NOS1mRNA轉(zhuǎn)錄效率提高

為進(jìn)一步確定上述NOS1mRNA水平的增加是否由轉(zhuǎn)錄效率的提高而引起，我們同時(shí)進(jìn)行了nuclear run-off實(shí)驗(yàn)。提取對(duì)照組和TSA刺激組的細(xì)胞核，在32P標(biāo)記的UTP存在條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。新合成的mRNA與含人NOS1或β-actin cDNAs的pMD18-T質(zhì)粒探針進(jìn)行雜交。在TSA作用下，βactin的轉(zhuǎn)錄無明顯改變，而NOS1的轉(zhuǎn)錄效率顯著提高（圖2）。因此，TSA引起的NOS1mRNA表達(dá)水平的上調(diào)與其轉(zhuǎn)錄效率的改變一致。

3 討論

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）和組蛋白去乙?；福℉DAC）是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙酰化水平的兩類酶。這兩類酶的平衡對(duì)于維持蛋白質(zhì)恰當(dāng)?shù)囊阴；街陵P(guān)重要。一旦平衡破壞將產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)乙?；蛉ヒ阴；?，并可導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。因此，很多治療策略集中在對(duì)蛋白質(zhì)乙?；癄顟B(tài)的調(diào)節(jié)。新近的研究發(fā)現(xiàn)許多HDAC抑制劑可特異性抑制HDAC的作用，并在轉(zhuǎn)錄過程中募集HAT，從而引起蛋白質(zhì)乙?；?，而對(duì)多種基因表達(dá)水平產(chǎn)生影響，具有多種潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值［3］。曲古抑菌素A（TSA）是一種鏈霉素生成物，1990年Yoshida等［10］首先報(bào)道了它在體內(nèi)及體外條件下能夠特異性抑制去乙?；傅淖饔茫瑥亩鸬鞍踪|(zhì)乙?；?。例如，它能夠通過抑制HDAC6的作用而上調(diào)α-微管蛋白的乙?；剑瑥亩鴱浹a(bǔ)Huntington′s病中基于微管的運(yùn)輸缺陷［4］。因此，本研究就選擇了TSA作為刺激因素。

NO由一氧化氮合酶（NOS）催化產(chǎn)生，它共有3種亞型，即神經(jīng)型（NOS1）、誘導(dǎo)型（NOS2）和內(nèi)皮型（NOS3）。研究發(fā)現(xiàn)HAT及HDAC是NOS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。例如，HDAC的抑制可增強(qiáng)結(jié)合在NOS3近端啟動(dòng)子的H3、H4組蛋白乙?；?，從而引起其mRNA表達(dá)水平上調(diào)［5］。NOS1在神經(jīng)系統(tǒng)中尤為重要，并與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)［6］。本研究中我們以TSA為乙酰化作用因素，檢測(cè)乙?；瘜?duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中NOS1基因表達(dá)水平的影響。我們的結(jié)果顯示TSA能夠以時(shí)間和濃度依賴方式上調(diào)NOS1基因mRNA表達(dá)水平，這提示了乙?；瘏⑴c了NOS1mRNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。Nuclear run-off實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)基因mRNA動(dòng)態(tài)變化的方法，它可以排除mRNA半衰期等改變對(duì)mRNA水平的影響，因此我們進(jìn)一步應(yīng)用該方法檢測(cè)了NOS1轉(zhuǎn)錄效率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA能夠上調(diào)NOS1轉(zhuǎn)錄效率，與mRNA水平的變化一致，證明了TSA引起的NOS1mRNA水平的增加至少部分是由于其轉(zhuǎn)錄效率的增加而引起的。

綜上，本研究結(jié)果證明TSA引起的乙酰化可使神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中NOS1基因mRNA表達(dá)及NOS1轉(zhuǎn)錄效率增加，這有可能為研究某些NO相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制提供分子基礎(chǔ)并為其治療提供新的靶標(biāo)，而關(guān)于TSA上調(diào)NOS1表達(dá)的確切分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

［1］Dawson TM，Dawson VL，Snyder SH.Anovel neuronal messenger molecule in brain：the free radical，nitric oxide.Ann Neur，1992，32（3）：297-311.

［2］Yoshida M，Kijima M，Akita M，et al.Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A.JBiol Chem，1990，265（28）：17174-17179.

［3］Tang YA，Wen WL，Chang JW，et al.ANovel Histone Deacetylase Inhibitor Exhibits Antitumor Activity via Apoptosis Induction，F(xiàn)Actin Disruption and Gene Acetylation in Lung Cancer.PLoSOne，2010，5（9）.pii：e12417.

［4］Dompierre JP，Godin JD，Charrin BC，et al.Histone deacetylase 6inhibition compensates for the transport deficit in Huntington′s disease by increasing tubulin acetylation.JNeurosci，2007，27（13）：3571-3583.

［5］Gan Y，Shen YH，Wang J，et al.Role of histone deacetylation in cellspecific expression of endothelial nitric-oxide synthase.JBiol Chem，2005，280（16）：16467-16475.

［6］Chabrier PE，Demerle-Pallardy D，Auguet M.Nitric oxide synthases：targets for therapeutic strategies in neurological diseases.Cell Mol Life Sci，1999，55（8-9）：1029-1035.

（編輯 孫憲民，英文編輯 陳 姜）

Effect of Trichostatin AonNOS1Gene Transcription in Glioma Cells

LIYing-hui，LIChun-yi，CHENFang-jie，ZHAOYan-yan
（Department of Medical Genetics，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effect of acetylation on neuronal nitric oxide synthase（NOS1）gene transcription in rat glioma C6cells by using trichostatin A（TSA）as a treatment of acetylation.MethodsThe expression level ofNOS1mRNAin C6cells treated with different concentrations of TSAwas detected by real-time reverse transcription polymerase chain reaction at different time points.Nuclear run-off assay was performed to assess the changes in NOS1transcription rate in C6cells treated with TSA.ResultsTSAupregulatedNOS1mRNAexpression in a time-and concentration-dependent manner in C6cells.TSAincreased the transcription rate ofNOS1gene markedly.ConclusionTSA-induced acetylation may upregulateNOS1gene transcription in C6cells.

NOS1；trichostatin A；acetylation

R394

A

0258-4646（2010）11-0901-03

遼寧省教育廳高?？蒲谢鹳Y助項(xiàng)目（2008858）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30900807）

李英慧（1976-），女，副教授，博士.

趙彥艷，E-mail：yyzhao@mail.cmu.edu.cn

2010-09-03