王曉華，王揚，蔣濤，付立業(yè)，姜又紅

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所，沈陽 110001）

人皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)及生物學(xué)特性

王曉華，王揚，蔣濤，付立業(yè)，姜又紅

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所，沈陽 110001）

目的 探索和建立人皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，為皮膚成纖維細(xì)胞在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。方法 胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞；細(xì)胞生長曲線及MTT法測定細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞生長周期及細(xì)胞增殖指數(shù)；倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)；HE染色觀察細(xì)胞爬片下的形態(tài)及著色；免疫組織化學(xué)染色觀察成纖維細(xì)胞中間絲波形蛋白；電子顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 體外用胰蛋白酶消化法建立了人皮膚成纖維細(xì)胞；傳5代內(nèi)細(xì)胞及傳5代內(nèi)凍存復(fù)蘇后人皮膚成纖維細(xì)胞增殖能力均很強；倒置鏡下觀察、HE染色、波形蛋白免疫組化染色及電鏡下觀察鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生物學(xué)特性符合成纖維細(xì)胞。結(jié)論 本研究確立了體外人皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)。

人；皮膚；原代培養(yǎng)；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖指數(shù)；細(xì)胞形態(tài)學(xué)

隨著年齡的增長，皮膚會出現(xiàn)松弛、干燥粗糙、彈性下降、皺紋增多等老化現(xiàn)象，這些現(xiàn)象都與成纖維細(xì)胞數(shù)量減少以及分泌合成功能下降或異常有關(guān)［1］。人皮膚成纖維細(xì)胞是皮膚真皮網(wǎng)織層中最重要的細(xì)胞，是皮膚衰老和細(xì)胞受損后的主要修復(fù)細(xì)胞之一［2］。它不但能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化，還能分泌大量的膠原蛋白、彈性纖維蛋白及多種細(xì)胞修復(fù)因子，具有強大的自我更新能力［3］，從而修復(fù)老化的皮膚。成纖維細(xì)胞是維持皮膚彈性和韌性的重要細(xì)胞［4］，因其特有的生物學(xué)特性，在抗皮膚衰老中起著重要的作用。本研究擬通過皮膚成纖維細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)，觀察、總結(jié)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性，在細(xì)胞水平上對皮膚成纖維細(xì)胞的形態(tài)及生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以獲得在體外穩(wěn)定生長的皮膚成纖維細(xì)胞，為成纖維細(xì)胞在醫(yī)學(xué)美容除皺術(shù)中的應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)［5］。

1 材料與方法

1.1 材料

皮膚標(biāo)本為兒童陰莖環(huán)切包皮2塊，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿科提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、碘化丙錠、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB），美國 Sigma公司產(chǎn)品；Ⅱ型膠原酶，美國Worthington公司產(chǎn)品；RNA酶，德國AppliChem公司產(chǎn)品；波形蛋白抗體，丹麥Dako公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱（MLO-20AIC），日本Sanyo公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡（Imt-413），日本Olympus公司產(chǎn)品；酶標(biāo)分析儀RT6000，美國雷杜公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品；透射電鏡（TEM-1200，1011EX），中國醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)：陰莖環(huán)切包皮2塊，每塊約2cm×3cm，將組織反復(fù)用含抗菌素的PBS漂洗，去除脂肪和結(jié)締組織及皮下血管，將組織剪成0.5cm×1.5cm的皮條，放入離心管，加2mg/ml的Ⅱ型膠原酶消化液，4℃過夜，去表皮，分離真皮，加0.25%胰蛋白酶反復(fù)吹打消化，用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基清洗，離心 1200r/min，8min，棄上清，按 1×105/ml細(xì)胞濃度加10%牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，據(jù)細(xì)胞生長情況傳代和換液。

1.2.2 測定細(xì)胞生長曲線：分別將培養(yǎng)第2代和第5代的成纖維細(xì)胞消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×104/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種1ml，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24h收集3孔細(xì)胞并計數(shù)，取平均值，連續(xù)計數(shù)7d后繪制生長曲線。

1.2.3 測定凍存細(xì)胞生長曲線：分別將培養(yǎng)第2代和第5代成纖維細(xì)胞常規(guī)凍存于液氮，4周后復(fù)蘇，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×104/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24h收集3孔細(xì)胞并計數(shù)，取平均值，連續(xù)計數(shù)7d后繪制生長曲線。

1.2.4 MTT法測定細(xì)胞的增殖能力：取對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞消化稀釋，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×104/ml。接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加100μl細(xì)胞懸液。分設(shè)原代培養(yǎng)第2代、第5代細(xì)胞和凍存復(fù)蘇后的第2代、第5代細(xì)胞4組，對照組選擇了正常人胚肺成纖維細(xì)胞，每組設(shè)5個重復(fù)孔，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h后加MTT。4h后終止培養(yǎng)，每孔加入二甲基亞砜150ml溶解，振蕩10min，波長選570nm，參考波長選490nm，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光密度（optical density，OD）值，測定細(xì)胞的增殖能力。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：分別取對數(shù)生長期的原代培養(yǎng)第2代、第5代以及凍存復(fù)蘇后的第2代和第5代成纖維細(xì)胞，對照組選擇正常人胚肺成纖維細(xì)胞。常規(guī)消化，用冷PBS清洗，1500r/min離心8min。棄上清液，加2.5ml冷PBS溶液重懸細(xì)胞，然后緩慢加入-20℃預(yù)冷的95%乙醇7.5ml，乙醇的終濃度為75%，冰浴4h固定；2000r/min離心8min，去除乙醇固定溶液。用適量1%血清PBS將其移入1.5ml的尖底離心管內(nèi)，1000r/min離心8min。棄上清液，加 50μg/ml的 RNA酶溶液 100μl，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min，然后冰浴終止酶作用。加等量50μg/ml碘化丙錠應(yīng)用液。4℃閉光染色30min，流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期。

1.2.6 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：培養(yǎng)48h后，倒置顯微鏡下定期觀察細(xì)胞，記錄照相。

1.2.7 HE染色：收集培養(yǎng)第3代的成纖維細(xì)胞以2×105/ml密度行細(xì)胞爬片，24h后終止培養(yǎng)，PBS充分漂洗細(xì)胞，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片備用。

1.2.8 免疫組織化學(xué)染色檢測波形蛋白：細(xì)胞以2×105/ml密度行細(xì)胞爬片，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞爬滿玻片的40%～60%時，取出玻片，PBS漂洗，3%的過氧化氫室溫孵育5min，PBS漂洗，滴加即用型鼠抗人波形蛋白一抗，置4℃冰箱過夜；PBS漂洗后加入羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫30min；PBS漂洗后DAB顯色1min，蘇木素復(fù)染。備用。

1.2.9 成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察：取對數(shù)生長期第3代成纖維細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞總量在2×1010，PBS清洗1000r/min離心8min，再用1∶1的PBS與2.5%戊二醛固定液，1000r/min離心8min，棄上清，沉淀細(xì)胞，再用PBS配制2.5%的戊二醛固定2h，經(jīng)脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色備用。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生長曲線測定結(jié)果

成纖維細(xì)胞的倍增時間較短，生長曲線中，在一段時間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量與時間呈正相關(guān)，0～1d為潛伏期、1～3d為細(xì)胞增殖期、3～5d為對數(shù)生長期、5～7d為平臺期，傳代后的成纖維細(xì)胞增殖能力與原代細(xì)胞比較顯示出同樣的增殖能力，凍存復(fù)蘇后的成纖維細(xì)胞雖受到復(fù)蘇成活率的影響在潛伏期內(nèi)有負(fù)增殖，但在第2天后仍表現(xiàn)出很強的增殖能力。原代培養(yǎng)第2代和第5代細(xì)胞的增殖能力與凍存復(fù)蘇后的同代次細(xì)胞比較也無明顯差異。見圖1。

2.2 MTT檢測結(jié)果

人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力很強。MTT檢測原代培養(yǎng)第2代、第5代以及凍存復(fù)蘇后的同代次細(xì)胞的活細(xì)胞染色的平均OD值分別為1.086±0.022、1.097±0.025、1.018±0.018和 1.035±0.020，與對照組人胚肺成纖維細(xì)胞的平均OD值（0.435±0.024）比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力較人胚肺成纖維細(xì)胞強。原代培養(yǎng)第2代與第5代成纖維細(xì)胞比較OD值無統(tǒng)計學(xué)差異，且與它們凍存復(fù)蘇后的同代次細(xì)胞比較OD值也沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 人皮膚成纖維細(xì)胞生長曲線Fig.1 Growth curve of human skin fibroblasts

2.3 流式細(xì)胞儀測定結(jié)果

成纖維細(xì)胞周期S期細(xì)胞百分比和增殖指數(shù)（proliferative index，PI）可反映細(xì)胞增殖活力的高低。不同代次成纖維細(xì)胞以及它們凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞生長周期見表1。原代培養(yǎng)第2代、第5代及復(fù)蘇后第2代、第5代S期細(xì)胞百分比和PI值各實驗組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異；對照組S期細(xì)胞百分比和PI值相對較低，各實驗組與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見表 1。

表1 成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期和增殖指數(shù)（±s，n=5）Tab.1 Cell cycle and proliferative index of fibroblasts（x ±s，n=5）

表1 成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期和增殖指數(shù)（±s，n=5）Tab.1 Cell cycle and proliferative index of fibroblasts（x ±s，n=5）

1）P<0.05vs control group.

Group G0/G1（%） S（%） G2/M（%） PI（%）The second passage of primary culture 24.10±1.02 46.28±0.981） 29.20±1.45 75.48±0.741）The fifth passage of primary culture 22.38±0.73 49.33±1.211） 28.29±0.88 77.62±0.641）The second passage after cryopreservation 27.38±0.73 46.40±0.661） 26.22±0.91 72.62±1.071）The fifth passage after cryopreservation 28.12±1.27 43.56±1.101） 28.31±0.65 71.88±0.861）Control 49.78±0.49 32.33±0.71 17.89±1.01 50.22±0.55

2.4 倒置顯微鏡下成纖維細(xì)胞形態(tài)

原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞接種3～5d時就開始貼壁，5～7d時細(xì)胞開始生長繁殖，7～9d后繁殖旺盛，相互融合成片。倒置鏡下見細(xì)胞大多呈長梭形、扁平星形，部分呈三角形，原代中的細(xì)胞有許多沒有伸展的圓型細(xì)胞。細(xì)胞在生長旺盛時代謝物增多，在倒置顯微鏡下細(xì)胞排列成簇狀。見圖2。

圖2 倒置鏡下觀察成纖維細(xì)胞形態(tài) ×20Fig.2 Morphology of fibroblasts observed under inverted microscope×20

2.5 HE染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下觀察，細(xì)胞為多角形或長梭形，核較大，胞質(zhì)較多，細(xì)胞核圓形或橢圓形，單核。胞核著淡藍(lán)紫色，胞質(zhì)著粉紅色。見圖3。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測波形蛋白

波形蛋白組化染色顯示，成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有棕黃顆粒或胞質(zhì)著棕黃色，胞核不著色，見圖4。

2.7 成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

圖3 成纖維細(xì)胞HE染色 ×20Fig.3 HEstaining of fibroblasts×20

圖4 成纖維細(xì)胞波形蛋白免疫組織化學(xué)染色 ×20Fig.4 Immunohistochemical staining of vimentin in fibroblasts×20

透射電鏡下見成纖維細(xì)胞與纖維細(xì)胞比較核增大，細(xì)胞核/質(zhì)比例減小，細(xì)胞核固縮，核仁大、明顯，染色質(zhì)凝集，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逐漸擴(kuò)張，排列無序。見圖5。

3 討論

圖5 透射電鏡下成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) ×6000Fig.5 Ultrastructure of fibroblasts obseved under transmission electron microscope×6000

皮膚為人體最大的器官，成纖維細(xì)胞是皮膚真皮層中主要細(xì)胞，而且是人體最容易獲得的體細(xì)胞［6］。由于人皮膚成纖維細(xì)胞比較容易獲取，所以小面積皮膚即可獲得較多的原代細(xì)胞，通過傳代可得到高純度的成纖維細(xì)胞。生長曲線中，在一定時間內(nèi)，細(xì)胞數(shù)量隨時間的增加而呈正增殖狀態(tài)，0～1d為潛伏期、1～3d為細(xì)胞增殖期、3～5d為對數(shù)生長期、5～7d為平臺期，傳代后的細(xì)胞增殖能力與原代細(xì)胞比較顯示出同樣的增殖能力，凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞雖受到復(fù)蘇成活率的影響在潛伏期內(nèi)有負(fù)增殖，但在有限的傳代次數(shù)內(nèi)仍表現(xiàn)出很強的增殖能力。

MTT法檢測的是活細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞的增殖能力，死細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)，可觀察到細(xì)胞生長活力和增殖數(shù)量，OD值高，表明活細(xì)胞數(shù)量高，細(xì)胞增殖能力強。不同代次及凍存復(fù)蘇后的人皮膚成纖維細(xì)胞增殖能力都很強，與細(xì)胞生長曲線的結(jié)果一致。表明成纖維細(xì)胞的倍增時間較短，在體外擴(kuò)增速度快，擁有較強的分化潛力，這是皮膚成纖維細(xì)胞可作為靶細(xì)胞進(jìn)行多種治療的最重要的條件。

細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，存在一個特殊的G1/S限制點，一旦越過限制點就進(jìn)入S期而處于增殖分裂狀態(tài)［7］。細(xì)胞是否能通過限制點受一系列特異或非特異的因素的影響。其中G1期細(xì)胞百分比的減少、S期細(xì)胞百分比增加，提示細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，PI值增高，細(xì)胞增殖活性強。本研究結(jié)果顯示，不同代次成纖維細(xì)胞以及它們凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞都能順利通過G1/S限制點而進(jìn)入S期，S期細(xì)胞百分比相對較高，PI值就高，說明處于增殖分裂狀態(tài)的細(xì)胞比例較高，細(xì)胞增殖能力強。這樣的增殖能力對皮膚衰老細(xì)胞及創(chuàng)傷的修復(fù)起著決定的作用。

體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性。它的形態(tài)多樣是依其細(xì)胞的生物學(xué)特性及功能變化而不同的，多呈大多角形和扁平星形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體均發(fā)達(dá)，合成膠原蛋白的功能較強，是由胚胎時期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來的［8］。波形蛋白就存在于間充質(zhì)細(xì)胞中，是鑒定成纖維細(xì)胞的一個很好的指標(biāo)。成纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白波形蛋白，不同于上皮細(xì)胞的角蛋白，也不同于肌細(xì)胞的橋連蛋白，成為成纖維細(xì)胞鑒定的特異性的標(biāo)志［9］。

成纖維細(xì)胞能分泌和合成膠原蛋白、彈性蛋白及多種細(xì)胞修復(fù)因子［10］，其中最主要的功能是合成膠原蛋白。而膠原蛋白是維持皮膚與肌肉彈性的主要成分。在皮膚衰老和創(chuàng)傷修復(fù)的過程中生長因子可刺激成纖維細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)合成、細(xì)胞外沉淀和分解再吸收等一系列動態(tài)過程完成膠原蛋白的合成。在這一過程中，成纖維細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，主要是細(xì)胞核和核仁變肥大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，從而獲得大量合成膠原蛋白的能力。而成纖維細(xì)胞正是在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成前膠原的，其中脯氨酸及賴氨酸經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的脯氨酸羥化酶和賴氨酸羥化酶催化，形成羥脯氨酰和羥賴氨酰，它們是膠原蛋白的重要組成部分。

人體皮膚衰老和創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程。成纖維細(xì)胞是這一生物過程中的主要修復(fù)細(xì)胞之一，而且是未來最有希望的基因治療細(xì)胞之一。

［1］叢敬，關(guān)景東.老化成纖維細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2009，18（5）：736-738.

［2］趙娟，石艷，孫波，等.人皮膚成纖維細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定［J］.吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2008，34（5）：899-902.

［3］Li L，Wang X，Liu W，et al.Analysis of factors related to female facial wrinkles：a survey of 1004Chinese women of Han nationality ［J］.JPrac Aesth Plastic Surg，2004，15（3）：126-128.

［4］吳國平，周燕，譚文松，等.人皮膚成纖維細(xì)胞在二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長代謝特性［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（1）：74-77.

［5］趙娟，李相軍，于曉艷，等.自體皮膚成纖維細(xì)胞在醫(yī)學(xué)美容中的應(yīng)用研究［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2008，17（2）：225-228.

［6］王孟麗，沈曉麗，林真，等.人皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)的研究［J］.心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009，18（4）：449-452.

［7］Wu GX，Wu JJ，Zhu TY，et al.The building of Human skin fibroblast cell bank［J］.JPra Med，2005，22（4）：324-326.

［8］嚴(yán)玉蘭，劉洋，步雪峰，等.鼠肺細(xì)胞的分離存化及原代培養(yǎng)［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2008，18（1）：11-14.

［9］Kueper T，Grune T，Muhr GM，et al.Modification of vimentin：a general mechanism of nonenzymatic glycation in human skin［J］.Ann NYAcad Sci，2008，26（2）：328-332.

［10］Zheng J，Huang XY，Wei X.Astudy on the promoting effects of recombinant human epidermal growth factor on skin wound healing in rats［J］.Chin JPlastic Surg，2005，5（21）：379-383.

（編輯 陳 姜，英文編輯 陳 姜）

Primary Culture and Biological Characteristics of Human Skin Fibroblasts

WANGXiao-hua，WANGYang，JIANGTao，F(xiàn)ULi-ye，JIANGYou-hong
（Cancer Research Institute，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo establish a method for primary culture of human skin fibroblasts and to provide a reliable basis for clinical application of skin fibroblasts.MethodsHuman skin fibroblasts were cultured with trypsin digestion.The proliferation of fibroblasts was detected by growth curve and MTTassay.The cell cycle and proliferation index were determined by flow cytometry.The morphology and ultratructure of the fibroblasts was observed under inverted and electron microscope，respectively.Immunohistochemical staining was performed to observe the vimentin in fibroblasts.ResultsHuman skin fibroblasts were obtained.The proliferative ability of the fibroblasts was high within 5passages or after cryopreservation.The morphology and biological characteristics of fibroblasts were confirmed under inverted and electron microscope and by HEand immunohistochemical staining.ConclusionThe method for primary culture of human skin fibroblasts in vitro is successfully established.

human；skin；primary culture；fibroblast；cell proliferation index；cell morphology

R318.08

A

0258-4646（2010）12-1041-04

遼寧省科學(xué)技術(shù)基金資助項目（2008225010-12）

王曉華（1958-），女，副主任技師，本科.E-mail：just_wxh@hotmail.com

2010-08-31

·短篇論著·