張璐，李春生，趙峰，林子清

（中國刑事警察學院 法醫(yī)學系，沈陽 110035）

狗是一種常見的犬科哺乳動物，屬狼的近親，也是飼養(yǎng)率最高的寵物。對狗的經(jīng)濟價值及骨組織工程方面的研究較多，但對其骨組織形態(tài)學的研究報道較少，目前國內(nèi)外的學者也只是對其骨組織形態(tài)的部分特征進行了簡單的描述。本研究將狗股骨中段做成骨骼組織學切片后采用硫堇苦味酸染色法進行染色，觀察其鏡下結(jié)構(gòu)，以期對其骨組織形態(tài)學進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

在集市上購買2年生以上家犬50只，雌雄不限，體質(zhì)量20~50 kg，采用靜脈輸入過量麻醉藥物的方法處死后取其右后股骨的中段備檢。

1.2 方法

1.2.1 固定：取上述檢材，將股骨中段鋸成厚3~5 mm的橫段，放入10%福爾馬林溶液中固定3~5 d。

1.2.2 脫鈣：分別按照Murayama法和Alexander法配制甲酸脫鈣液和硝酸脫鈣液［1］。

1.2.3 包埋切片：將脫鈣后的骨組織流水沖洗24 h后，用冷凍組織包埋劑（OCT）包埋，放在冷凍切片機（英國Brother公司）冷凍室內(nèi)3~5 min，使其完全凍結(jié)后，切成20 μm厚的薄片，放入無水乙醇中備用。

1.2.4 染色封片：按常規(guī)配制硫瑾/苦味酸染色液，室溫下采用游離方法染色，用中性合成樹膠封片［2］。

1.2.5 切片觀察指標：采用Nikon ECLIPSE 80i病理圖像處理系統(tǒng)200倍鏡下觀察哈氏系統(tǒng)的數(shù)量、形態(tài)、直徑、面積及排列，間骨板的數(shù)量、形態(tài)、排列、面積百分比、環(huán)層骨板形態(tài)，內(nèi)、外環(huán)骨板的厚度及相對厚度，非哈氏管的數(shù)量。400倍鏡下觀察哈氏系統(tǒng)環(huán)層骨板數(shù)，哈氏管直徑及面積，間骨板環(huán)層骨板數(shù)，骨陷窩數(shù)量、排列和面積。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，利用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 外環(huán)骨板和內(nèi)環(huán)骨板

狗股骨外環(huán)骨板60%沒有完整的結(jié)構(gòu)，形態(tài)多不連續(xù)，厚薄不等，平均厚度（135.11±63.91）μm。平均相對厚度0.877，與內(nèi)環(huán)骨板相同，均主要以呈層狀排列的梭形骨細胞的形式存在。梭形細胞較小，排列比較致密，有些細胞呈條狀，外環(huán)骨板形態(tài)較內(nèi)環(huán)骨板明確（圖1）。

圖1 狗股骨火棉膠切片 ×200Fig.1 Collodion slice of the dog×200

內(nèi)環(huán)骨板平均厚度（98.86±49.99）μm，平均相對厚度0.065。內(nèi)環(huán)骨板厚薄不均，有少數(shù)骨單位的部分內(nèi)環(huán)骨板不連續(xù)。內(nèi)環(huán)骨板大多分層不明顯，梭形細胞較大，排列比較疏松，但骨單位均不向骨髓腔內(nèi)突入（圖2）。

圖2 狗股骨火棉膠切片 ×200Fig.2 Collodion slice of the dog×200

2.2 骨單位

骨單位從形態(tài)上可以分為規(guī)則和不規(guī)則骨單位兩種，嵌到內(nèi)外環(huán)骨板中的骨單位僅有1層環(huán)纖維骨板，中央管徑較小。骨密質(zhì)中的骨單位多為第一代骨單位，可見少量第二代骨單位。平均有4層骨細胞構(gòu)成的環(huán)纖維骨板邊緣較清。哈佛系統(tǒng)平均直徑（133.40±19.01）μm，其面積平均（14147.82±4383.66）μm2，邊緣較清晰，圓形或類圓形，其中以圓形為主。環(huán)纖維骨板較厚，邊緣境界較清晰。哈氏管直徑相對較大，其平均直徑（23.44±7.27）μm，其面積平均（466.86±293.99）μm2。間骨板較少，條索狀或半月狀無規(guī)律填充于骨單位之間。骨細胞多為短梭形或菱形，排列不規(guī)則，髓質(zhì)側(cè)的哈佛系統(tǒng)多而大，邊緣較清晰，排列較皮質(zhì)側(cè)規(guī)則。皮質(zhì)側(cè)的哈佛系統(tǒng)少而小，哈氏管面積相對較大（圖3）。

圖3 狗股骨火棉膠切片 ×200Fig.3 Collodion slice of the dog×200

2.3 骨陷窩

骨陷窩數(shù)量較多，鏡下一個視野內(nèi)54~135個，平均為（93.04±18.96）個?？拷べ|(zhì)側(cè)的骨陷窩呈梭形，有層狀排列的趨勢。中部或靠近內(nèi)環(huán)骨板處的骨陷窩排列不規(guī)則，形態(tài)也多呈圓形或類圓形。骨陷窩大小不均，最大 174.35 μm，最小 15.00 μm，平均（37.34±10.44）μm。各骨陷窩周圍可見較多的呈放射狀排列的骨小管，各骨陷窩之間的骨小管相互交錯和連接。

2.4 非哈氏管

非哈氏管數(shù)量平均為（0.32±0.44）個。最多者每個視野中有2個，大多數(shù)沒有非哈氏管。排列不規(guī)則，無規(guī)律性，大小不等，形狀不一。

2.5 叢狀骨

有6例內(nèi)外骨板間幾乎全部為叢狀骨，其余少數(shù)近皮質(zhì)側(cè)有不明顯的叢狀骨，髓質(zhì)側(cè)沒有叢狀骨。

2.6 骨小梁及骨單位帶

未見。

3 討論

由于狗的存在具有悠久的歷史，和人類有著密切的關(guān)系，在生物學、考古學、法醫(yī)學尤其是種屬鑒定等領(lǐng)域的研究中占有特殊地位。我們參照人的骨切片制作方法，系統(tǒng)探索了狗股骨的骨組織切片制作和染色條件，證明通過改良人的骨組織切片制作條件，完全能夠制作出充分顯示狗股骨微細結(jié)構(gòu)特征的骨組織切片。

從我們的研究結(jié)果來看，狗股骨內(nèi)、外環(huán)骨板不規(guī)則，排列不均，且分層不明。外環(huán)骨板較內(nèi)環(huán)骨板發(fā)達。從髓質(zhì)側(cè)到皮質(zhì)側(cè)的哈氏系統(tǒng)面積逐漸減小，中央管面積相對增加，哈氏系統(tǒng)的排列漸不規(guī)則，沒有骨小梁結(jié)構(gòu)。而人的外環(huán)骨板走行不規(guī)則，波狀彎曲，環(huán)層骨板間有體積較小的菱形的骨單位。內(nèi)環(huán)骨板與骨密質(zhì)部的骨單位相連，有明顯的分界。內(nèi)環(huán)骨板較厚，波狀走行、連續(xù)。近內(nèi)環(huán)骨板處可見密集的直徑較小的骨單位。人類骨組織間骨板較多，面積百分比大，大多呈新月形結(jié)構(gòu)。有典型的骨小梁結(jié)構(gòu)。說明狗骨組織與人類骨組織相近，但又有顯著的差異，據(jù)此特征可與人骨進行鑒別［3，4］。

骨骼化是生物結(jié)構(gòu)復(fù)雜化的基礎(chǔ)，骨骼系統(tǒng)又是生物形態(tài)進化的限制因素。本研究的檢驗結(jié)果提示我們，觀察動物骨骼的組織學形態(tài)，不僅能夠幫助我們判斷其種屬，還能在一定程度上推斷出其進化程度。

［1］Kimball BA，Mishalamie EA.Gas chromatographic determination of sodium monofluoroacetate as the free acid in an aqueous solvent［J］.J Chromatogr，1993，634（2）：289-296.

［2］龔志錦，詹榕洲.病理組織制片與染色技術(shù)［M］.上海：上海科學技術(shù)出版社，1994：280.

［3］張繼宗，王國吉，張懷東.人與動物骨組織特征的比較研究［J］.刑事技術(shù)，2007，（5）：16-18.

［4］張繼宗.人類骨組織特征研究［J］.人類學學報，2008，27（4）：325-330.