歐霞，王雁，鄒海蓉，鄒建中，李崇雁

（重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，重慶 400016）

高強(qiáng)度聚焦超聲（high-intensity focused ultrasound，HIFU）技術(shù)在腫瘤的治療中發(fā)揮了重要作用［1］，其劑量和療效是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）存在于細(xì)胞核中，其表達(dá)的高低和程度與腫瘤細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)，乃目前公認(rèn)的一個(gè)細(xì)胞增殖相關(guān)基因［2］。本研究檢測HIFU不同劑量輻照后腫瘤及與正常組織交界的PCNA表達(dá)情況，擬探討細(xì)胞增殖活性與HIFU輻照劑量的關(guān)系及意義，為HIFU臨床療效提供參考。

1 材料與方法

1.1 兔肝VX2移植瘤模型的建立

健康純種新西蘭大白兔72只（重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體質(zhì)量1.5～2.0 kg，月齡2～3月，雌雄不限；VX2鱗癌細(xì)胞株瘤塊（日本Funbanski公司引進(jìn)，重慶醫(yī)科大學(xué)超聲醫(yī)學(xué)研究所提供）。采用包埋法，將1 mm×1 mm×1 mm大小的瘤塊植于開腹后擬接種的兔肝右中葉，止血、關(guān)腹、縫合切口，即制成荷瘤兔。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

輻照前1 d荷瘤兔禁食，前12 h禁水、備皮，術(shù)前5 min全麻后俯臥固定于手術(shù)臺(tái)，腹部完全浸入脫氣水。采用JC200型聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)（重慶海扶（HIFU）技術(shù)有限公司研發(fā)，治療參數(shù)：治療頭頻率為1.03 MHz，直徑為158 mm，焦點(diǎn)處聲強(qiáng)ISATA最高可達(dá)19894.38 W/cm2），治療頭定位腫瘤，以“線-面-體”的方式，由深至淺逐漸覆蓋整個(gè)腫瘤組織，僅掃描一遍，速度為3 mm/s，兩線間距4 mm，每層間距3 mm。以聲功率表示該組劑量（各組實(shí)驗(yàn)參數(shù)相同，每只腫瘤模型每立方厘米的輻照時(shí)間相同且最短），腫瘤模型按劑量平分為9個(gè)組，每組8只。

1.3 PCNA表達(dá)的檢測

輻照后24 h于靶區(qū)和腫瘤與正常組織交界處取材，PCNA免疫組化染色的具體方法按試劑盒說明進(jìn)行（SABC法）。PCNA表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)：每例標(biāo)本隨機(jī)選5張免疫組化切片，每張觀察5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野下100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為PCNA的陽性表達(dá)率，以百分率表示；細(xì)胞核染色呈棕色為過表達(dá)，棕黃色為強(qiáng)表達(dá)，黃色為弱表達(dá)，正常情況下胞質(zhì)及包膜不著色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)方法采用單向方差分析、t檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 PCNA陽性表達(dá)率

PCNA在VX2腫瘤靶區(qū)陽性率的表達(dá)隨輻照劑量的增加逐漸下降；交界組織PCNA陽性率先上升后下降，功率為100 W時(shí)，陽性率最高達(dá)（23.36±7.54）%，功率至180 W時(shí)，靶區(qū)及交界組織PCNA幾乎已無陽性表達(dá)（表1）。

表1 不同劑量HIFU輻照后PCNA陽性表達(dá)率的比較Tab.1 Comparison the expression of PCNA positive rate with different doses of HIFU irradiation

2.2 PCNA的表達(dá)程度及分布情況

VX2腫瘤靶區(qū)各組陽性細(xì)胞呈強(qiáng)表達(dá)或過表達(dá)，彌散、灶狀或片狀分布，陽性細(xì)胞中弱表達(dá)的比例隨輻照劑量的增加而增高（圖1）。交界組織陽性細(xì)胞包繞于腫瘤四周，基本為弱表達(dá)，強(qiáng)表達(dá)陽性細(xì)胞比例在80 W時(shí)達(dá)峰值（圖2）。

圖1 VX2兔肝移植瘤靶區(qū)組織PCNA免疫組化染色 ×400Fig.1 Observations of PCNA immunohistochemistry in VX2 rabbit liver tumor target tissues×400

圖2 VX2兔肝移植瘤與正常組織交界處PCNA免疫組化染色 ×400Fig.2 Observations of PCNA immunohistochemistry between the junction of VX2 rabbit liver tumor and normal tissues×400

2.3 線性相關(guān)性分析

輻照劑量為自變量，PCNA陽性表達(dá)率為因變量進(jìn)行相關(guān)性分析。當(dāng)功率小于100 W時(shí)，VX2腫瘤靶區(qū)PCNA陽性表達(dá)率與輻照劑量呈線性負(fù)相關(guān)，r為-0.956（P<0.01）；交界組織的 PCNA 陽性表達(dá)率與劑量變化有關(guān)，但非線性相關(guān)。

3 討論

一定強(qiáng)度的超聲波作用于組織細(xì)胞會(huì)使其產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，效應(yīng)程度取決于聲波強(qiáng)度（聲功率）［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，VX2腫瘤靶區(qū)PCNA陽性細(xì)胞表達(dá)率和強(qiáng)表達(dá)細(xì)胞比例均隨輻照劑量（功率）的增加而明顯下降至不表達(dá)，肯定了HIFU的治療效果；但腫瘤與正常組織交界處的陽性表達(dá)率和強(qiáng)陽性細(xì)胞表達(dá)比例卻分別于100 W、80 W時(shí)達(dá)峰值，可見HIFU輻照可誘導(dǎo)交界處PCNA的表達(dá)。Tam等［4］觀察到低強(qiáng)度超聲聲流明顯，可增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換，作者發(fā)現(xiàn)在42℃時(shí)能促進(jìn)PCNA表達(dá)、使肝細(xì)胞增殖［5］，根據(jù)熱平衡原理，超聲波作用于靶區(qū)的熱效應(yīng)也會(huì)對靶組織周圍細(xì)胞產(chǎn)生影響。免疫組化結(jié)果證實(shí)在較低劑量時(shí)，靶區(qū)組織空泡較少以熱效應(yīng)為主，并且交界處組織細(xì)胞核染色加深，而劑量增大靶區(qū)空泡也增多。

目前研究發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度超聲可通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度瞬間增強(qiáng)、整聯(lián)蛋白受體活化和ERK/ROCK/Rho信號途徑的開放等機(jī)制使生長因子表達(dá)增強(qiáng)，從而刺激細(xì)胞增殖［6，7］；但有學(xué)者認(rèn)為低強(qiáng)度超聲并不能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長增殖［8］。出現(xiàn)這種顯著差異，可能和實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備、超聲波輻照的參數(shù)、輻照方式、離體或者活體標(biāo)本的選擇及活體組織的生物學(xué)特性不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選用活體組織作為研究對象，以功率代替輻照劑量，結(jié)果顯示PCNA的陽性表達(dá)率與超聲輻照劑量之間在本實(shí)驗(yàn)所選劑量范圍內(nèi)沒有完整的線性關(guān)系，但靶區(qū)和交界處組織PCNA的表達(dá)規(guī)律確和劑量變化有關(guān)，最重要的原因可能就是超聲與活體組織間有信息反饋，是相互作用，并非單純的施加和接受的關(guān)系，而且不能排除整個(gè)機(jī)體調(diào)節(jié)和鄰近組織的影響。另一方面，輻照劑量（功率）繼續(xù)增加，交界處組織PCNA受到抑制，其陽性表達(dá)率也最終降至0%，說明達(dá)到一定劑量時(shí)，HIFU不僅能使靶區(qū)腫瘤細(xì)胞死亡，更能抑制甚至滅活腫瘤與正常組織交界處細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)以PCNA的變化規(guī)律作為評判方法，闡述HIFU輻照劑量和療效的關(guān)系，不僅說明HIFU是一種有效的腫瘤治療技術(shù)，更為臨床治療的劑量選擇提供了參考依據(jù)。

［1］Blana A，Murat F，Water B，et al.First analysis of the long-term results with transrectal HIFU in patients with localized prostate cancer［J］.Eur Urol，2008，53（6）：1194-1201.

［2］Qin HX，Nan KJ，Yang G，et al.Expression and clinical significance of Tap73a，p53，PCNA and apoptosis in hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2005，11（18）：2709-2713.

［3］Ter Haar G.Therapeutic application of ultrasound ［J］.Prog Biophys Mol Biol，2007，93（1-3）：111-129.

［4］Tam KF，Cheung WH，Lee KM，et al.Delayed stimulatory effect of low-intensity shockwaves on human periosteal cells ［J］.Clin Orthop Relat Res，2005，38（5）：260-265.

［5］李三強(qiáng)，席守民，馬靈筠，等.熱休克對小鼠肝細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響.中華實(shí)用中西醫(yī)雜志［J］.2008，21（23）：1725-1726.

［6］Liu Y，Yang H，Takatsuki H，et al.Effect of ultrasonic exposure on Ga2+-ATPase activity in plasma membrane from Aloe arborescens callus cells［J］.Ultrason Sonochem，2006，13（3）：232-236.

［7］Takenchi R，Ryo A，Komistu N，et al.Low-intensity pulsed ultrasound activates the PI3K/Akt pathway and stimulates the growth of chondrocytes in 3D-cultures：a basic science study［J］.Arthritis Res Ther，2008，10（4）：R77.

［8］Hsu SH，Huang TB.Bioeffect of ultrasound on endothelial cells in vitro［J］.Biomol Eng，2004，21（3-5）：99-104.