李洋，劉彤，李丹妮，李豐

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物教研室，教育部細(xì)胞生物學(xué)重點實驗室；2.94期臨床醫(yī)學(xué)，沈陽 110001）

hRNF6基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá)和定位

李洋1，劉彤1，李丹妮2，李豐1

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物教研室，教育部細(xì)胞生物學(xué)重點實驗室；2.94期臨床醫(yī)學(xué)，沈陽 110001）

目的 構(gòu)建環(huán)指蛋白6（RNF6）真核表達(dá)載體，并證實融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位。方法 提取工具細(xì)胞HEK-293的mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增hRNF6全長編碼基因，并將其克隆至pCDNA3.1-myc-his A及pEGFP-C1表達(dá)載體中。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒測序并轉(zhuǎn)染到工具細(xì)胞HEK-293中，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測。利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察pEGFP-RNF6在工具細(xì)胞CV-1和胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)的定位。結(jié)果hRNF6全長基因序列克隆到了真核表達(dá)載體pCDNA3.1-myc-his A和pEGFP-C1中，酶切鑒定片段為2058bp。Western blot檢測到了融合蛋白表達(dá)，分子量約為78kDa。pEGFP-RNF6在CV-1細(xì)胞和胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)定位以細(xì)胞核為主，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)少量表達(dá)。結(jié)論 成功的構(gòu)建了hRNF6全長基因真核表達(dá)載體，pEGFP-RNF6蛋白主要定位于胃癌細(xì)胞核內(nèi)。

環(huán)指蛋白6；基因克??；融合蛋白；轉(zhuǎn)染；胃癌

靶蛋白的水解作用是細(xì)胞調(diào)節(jié)的一種重要機(jī)制，錯誤折疊的或者與內(nèi)環(huán)境不相適應(yīng)的靶蛋白將被細(xì)胞降解［1］。泛素蛋白酶系統(tǒng)為充分降解靶蛋白提供了一種有效的途徑。蛋白質(zhì)泛素化作用是由一系列的酶參與完成的多步化反應(yīng)：它包括泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶（ubiquitin-ligase，E3）［2］。在大多數(shù)情況下，E3參與底物的識別，在調(diào)節(jié)泛素與底物連接的特異性上起著中心作用［3，4］。環(huán)指蛋白（ring finger protein，RNF）是一類含有環(huán)指基的鋅指蛋白，是最大的E3家族，與E2泛素結(jié)合酶相結(jié)合，可促進(jìn)靶蛋白的降解，在蛋白質(zhì)降解代謝中作為蛋白質(zhì)特異性降解的泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）參與了細(xì)胞內(nèi)許多重要的生理生化過程［5］。UPS在腫瘤中的重要作用也逐漸被人們所認(rèn)識。因此，本研究構(gòu)建了人RNF6基因cDNA全長的真核表達(dá)載體，并證實了其融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位，為進(jìn)一步探討胃癌信號通路中RNF6的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

大腸桿菌DH5α為本實驗室制備；真核表達(dá)載體pEGFP-C1購于Clontech公司，pcDNA3.1-myc-his A購于Invitrogen公司；胃癌細(xì)胞系SGC-7901及工具細(xì)胞HEK-293、CV-1為本實驗室保存。

1.2 主要試劑

PryobestTMDNApolymerase，dNTP，凝膠回收試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑，限制性核酸內(nèi)切酶購自大連TaKaRa公司；TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；anti-myc抗體購自Santa Cruz公司；引物合成、DNA序列測定由上海生物工程有限公司完成；ECL發(fā)光試劑盒購自Pharmacia公司。

1.3 HEK-293總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞至90%融合，提取細(xì)胞總RNA。在3.5cm直徑的培養(yǎng)板中加入1ml TRIzol，用移液器反復(fù)吹打，直到細(xì)胞全部裂解。按照說明書進(jìn)行RNA提取后，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 hRNF6全長基因的擴(kuò)增

設(shè)計hRNF6擴(kuò)增的PCR引物，并在引物序列中分別加入KpnⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ限制性酶切位點。以HEK-293cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增hRNF6全長編碼序列。擴(kuò)增的條件為95℃5min預(yù)變性；95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 2min，此 3個溫度進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃10min。

1.5 pCDNA3.1-myc-hisA-hRNF6表達(dá)載體的構(gòu)建

將pCDNA3.1-myc-hisA載體和hRNF6PCR片段分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，同時將pEGFPC1載體和hRNF6PCR片段分別用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，37℃反應(yīng)過夜，凝膠回收純化產(chǎn)物。將2個片段用T4DNALigase于16℃連接過夜后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)菌，37℃過夜擴(kuò)培。用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用雙酶切鑒定外源基因的插入，進(jìn)行測序分析。

1.6 hRNF6真核表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染

用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，細(xì)胞鋪于6孔板至70%～80%融合，按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染6孔板的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

1.7 Western blot鑒定

轉(zhuǎn)染48h后，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2遍。收集細(xì)胞后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，裂解細(xì)胞。4℃13000g離心30min，取上清5μl進(jìn)行蛋白定量。取80μg總蛋白經(jīng)10%SDSPAGE凝膠分離，4℃過夜恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉3h，TBST洗膜15min，3次。用anti-myc抗體（1∶500稀釋）孵育，TBST洗膜15min，3次。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠（1∶5000稀釋）二抗孵育1h，TBST洗膜15min，3次。ECL顯色，發(fā)光。

1.8 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察EGFP-RNF6細(xì)胞內(nèi)定位

將真核表達(dá)載體pEGFP-RNF6轉(zhuǎn)染到工具細(xì)胞CV-124h后，應(yīng)用OLYMPUSFV1000S-SIM/IX81激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行掃描，激發(fā)光波長為488nm，可看到RNF6蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位處呈現(xiàn)綠色。

2 結(jié)果

2.1 人RNF6基因全長PCR擴(kuò)增（圖1）

以HEK-293cDNA為模板，特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增hRNF6全長。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明擴(kuò)增出與預(yù)計長度相符的長度為2058bp的野生型RNF6基因編碼區(qū)。

圖1 PCR擴(kuò)增hRNF6全長序列結(jié)果Fig.1 PCRamplification of the full lengthhRNF6

2.2 hRNF6重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將重組質(zhì)粒pCDNA3.1-myc-his A-hRNF6經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后得到了約5.5kb和2000bp左右的兩條帶，將重組質(zhì)粒pEGFP-hRNF6經(jīng)KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切后得到了約4.8kb和2000bp左右的2條帶。經(jīng)過測序分析，外源序列在NCBIBlast比對結(jié)果與hRNF6編碼序列一致。見圖2。

2.3 真核表達(dá)質(zhì)粒在HEK-293細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-myc-his A-hRNF6轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞系中，48h后將提取的蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，Western blot檢測到了融合myc-HisA-RNF6蛋白的表達(dá)。分子量約為78kDa，為質(zhì)粒本身的myc-HisA標(biāo)簽分子量（3～4kDa）和 hRNF6的分子量（75kDa）之和，說明融合蛋白表達(dá)。見圖3。

圖2 重組質(zhì)粒pCDNA3.1-myc-his A-RNF6和pEGFP-RNF6的酶切結(jié)果Fig.2 Restriction enzyme disgestion of the recombinant plasmid pCDNA3.1-myc-his A-RNF6and pEGFP-RNF6

圖3 融合蛋白myc-hRNF6的表達(dá)Fig.3 Western blot analysis of myc-HisA-hRNF6fusion protein

2.4 pEGFP-RNF6在細(xì)胞內(nèi)的定位

通過共聚焦激光掃描顯微鏡，我們觀察到pEGFP-RNF6無論在工具細(xì)胞CV1或胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞內(nèi)定位都以核為主，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)僅有少量表達(dá)。見圖4。

3 討論

圖4 pEGFP-RNF6在細(xì)胞內(nèi)的定位Fig.4 The localization of pEGFP-RNF6in the cells

蛋白質(zhì)代謝是生命體調(diào)節(jié)自身適應(yīng)環(huán)境的一種重要機(jī)制，而作為蛋白質(zhì)代謝中重要一環(huán)的降解代謝對生命行使的功能是不可或缺的。在蛋白質(zhì)降解代謝中作為蛋白質(zhì)特異性降解的泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）參與了細(xì)胞內(nèi)許多重要的生理生化過程。RNF6就是泛素化系統(tǒng)中的一種E3連接酶。RNF6是環(huán)指蛋白家族中的一員，環(huán)指蛋白的重要作用是參與蛋白的泛化作用，它能將泛素轉(zhuǎn)移到酶作用的底物上，然后通過蛋白酶的作用降解底物［6］。RNF6基因全長2058bp，編碼685個氨基酸，包括其N端的螺旋結(jié)構(gòu)域和C端的一個RING-H2指。研究表明，泛素連接酶和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本實驗從cDNA文庫中擴(kuò)增出了hRNF6的全長基因序列，并將其構(gòu)建到了真核細(xì)胞表達(dá)載體pCDNA3.1-myc-his A和pEGFP中。將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中，Western blot驗證融合蛋白在細(xì)胞中表達(dá)。利用共聚焦激光掃描顯微鏡證實，pEGFP-RNF6在胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)定位以細(xì)胞核為主，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)少量表達(dá)。基因全長的獲得和表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)的定位為進(jìn)一步研究RNF6的生物學(xué)特性打下了基礎(chǔ)。

［1］Timothy R，Thomas H，Zavolan M，et al.Systematic characterization of the zinc-finger-containing proteins in the mouse transcrip-tome［J］.Genome Res，2003，13（6b）：1430-1442.

［2］Sun Y.Targeting E3ubiquitin ligases for cancer therapy［J］.Cancer Biol Ther，2003，2（6）：623-629.

［3］Sullivan JA，Shirasu K，Deng XW．The diverse roles of ubiquitin and the 26Sproteasome in the life of plants［J］．Nat Rev Genet，2003，4（12）：948－958．

［4］Ulrich HD．Natural substrates of the proteasome and their recognition by the ubiquitin system［J］．Curr Top Microbiol Immunol，2002，268（1）：137-174．

［5］Potten CS，Booth C，Tudor GL，et al.Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker：musashil［J］.Differentiation，2003，71（1）：28-41.

［6］Joazeiro CA，Weissman AM，Mammen J.RINGfinger protein：mediators of ubiquitin ligase activity［J］.Cell，2000，102（5）：549-552.

（編輯 王又冬，英文編輯 趙傳勝）

Construction of the Recombinant Plasmid of HumanRNF6Gene and the Expression and Localization of Fusion Protein

LIYang1，LIUTong1，LIDan-ni2，LIFeng1
（1.Department of Cell Biology，College of Basic Medical Sciences，The Key Laboratory of Cell Biology of Ministry of Education of China，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.The 94th Class，F(xiàn)aculty of Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo construct an eukaryotic expression vector ofRNF6（ring finger protein 6）gene and identify its recombinant protein expression and localization.MethodsTotal mRNAwas extracted from HEK-293cells，cDNAwas formed by reverse transcripton.ThehRNF6coding sequence was amplified by polymerase chain reaction（PCR）method and cloned into pcDNA3.1-myc-his Avector and pEGFP-C1vector.After the target region was sequenced，the plasmid was transfected into HEK-293cell lines.The expression of the recombinant plasmid in HEK-293cells was proved by Western blot.The localization of pEGFP-RNF6in CV-1cell and gastric cancer cell SGC-7901was observed by using laser scanning confocal microscopy.ResultshRNF6had been constructed into expressing vector pCDNA3.1-myc-his Aand pEGFP-C1successfully.The length of the fragment was 2058bp，identified by restriction enzymes digestion.The expression of myc-RNF6fusion protein was detected by Western blot，with a molecular weight 78kDa.The pEGFP-RNF6protein was localized more in the nucleus，less in the cytoplasm.ConclusionThe recombinant plasmid was successfully cloned into eukaryotic expressing vector，the pEGFP-RNF6fusion protein was expressed mainly in the nucleus.

RNF6；gene cloning；fusion protein；transfection；gastric cancer

Q257

A

0258-4646（2010）12-0995-03

國家自然科學(xué)基金重大研究計劃（90813038）；國家自然科學(xué)基金資助項目（30771128）

李洋（1986-），女，碩士研究生.

李豐，E-mail：fli@mail.cmu.edu.cn

2010-09-08