戴 冰， 肖子曾， 梅 君， 冷 旺， 李興豐， 趙 婧， 廖建萍， 彭 柳

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410007)

六味地黃丸為棕褐色的濃縮丸，味微甜、酸、略苦，它是由六味中藥材組成:熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉。諸藥配伍，共奏滋陰補(bǔ)腎，用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱 、盜汗遺精、消渴［1］。其有效成分主要有苷類，如芍藥苷、馬錢(qián)苷、地黃苷等;酚性成分，如丹皮酚等;萜類，如澤瀉醇 A、B、C等及一些有機(jī)酸如沒(méi)食子酸、熊果酸等［2］。其中馬錢(qián)苷為2010版《中國(guó)藥典》收載的六

味地黃丸指標(biāo)成分之一，近年來(lái)對(duì)六味地黃丸中馬錢(qián)苷的研究較多［3-7］，但大多集中在體外成分含量測(cè)定方面，其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究鮮有報(bào)道。本研究在參考體外研究的基礎(chǔ)上，采用反相高效液相色譜法測(cè)定大鼠血清中馬錢(qián)苷的濃度，研究大鼠灌胃給藥后的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，這對(duì)臨床合理用藥及劑型的改進(jìn)都將具有指導(dǎo)意義，同時(shí)為中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究也提供了新的思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1100高效液相色譜儀(包括四元梯度泵、真空脫氣機(jī)、Chemstation software工作站，SPD-10AVP二極管陣列檢測(cè)器)，DT-100電子分析天平(北京光學(xué)儀器廠)，DL-360A超聲清洗機(jī)(上海之信儀器有限公司);MILLI-QB純凈水發(fā)生器(美國(guó)MILLIPORE公司)。

1.2 試藥 濃縮六味地黃丸(批號(hào):20080115，九芝堂股份有限公司);戊巴比妥鈉(批號(hào):86-01-22，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠);馬錢(qián)苷標(biāo)準(zhǔn)品(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，白色粉末，純度＞99.5%);乙腈(色譜純)、磷酸(分析純)、甲醇(色譜純)、乙醇(色譜純)、雙蒸水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠，清潔級(jí)，♀♂各半，體重(200±20)g，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第20-002號(hào)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);Nova-Pak C18Guard-PakTM保護(hù)柱。流動(dòng)相:0.05%磷酸水溶液(A)-乙腈(B);檢測(cè)波長(zhǎng):236 nm;柱溫:30℃;流速:1 mL/min;分析時(shí)間55 min，洗脫梯度見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備 取六味地黃丸400丸(每8丸相當(dāng)于生藥材量3 g)，加純凈水約300 mL，攪拌，煮沸，使其藥液濃縮至0.6 g/mL(按生藥材含量計(jì))，供實(shí)驗(yàn)用。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取馬錢(qián)苷對(duì)照品適量，加空白大鼠血清溶解，馬錢(qián)苷濃度為210 μg/mL，臨用前用空白血清稀釋至各所需濃度。

2.4 血清樣品的制備 大鼠按20 mL/kg給予供試品灌胃后，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)肝門(mén)靜脈取血5 mL，靜置4 h，3 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL，加入0.2 mL 70%高氯酸，快速搖勻，3 000 r/min條件下離心15 min，取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，備HPLC分析，血清-20℃冷凍保存，供實(shí)驗(yàn)用［8］

2.5 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn) 取Wistar大鼠，清潔級(jí)，♀♂各半，體重(200±20)g。按20 mL/kg給予供試品灌胃，給藥后分別于不同時(shí)間(0、5、10、15、30、45、60、120、180、240、360、450 min)肝門(mén)靜脈采血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。取血后按2.4項(xiàng)下方法制備含藥血清，進(jìn)樣20 μL，測(cè)量色譜峰面積，計(jì)算血藥濃度。

2.6 色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2.6.1 方法確證 在上述色譜條件下，馬錢(qián)苷的分離效果好，空白血清中的內(nèi)源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，含藥血清中的其他物質(zhì)成分均不干擾測(cè)定。理論塔板數(shù)不小于4 000，保留時(shí)間約為42.5 min?？瞻籽澹瞻籽逯屑尤腭R錢(qián)苷對(duì)照品，含藥血清及含藥血清加入馬錢(qián)苷對(duì)照品色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 空白血清、對(duì)照品、含藥血清HPLC圖

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 對(duì)照品溶液用空白血清稀釋成濃度分別為 2.6、5.2、10.5、21、42 μg/mL 的溶液，進(jìn)樣10 μL，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程，馬錢(qián)苷回歸方程為:Y=1.092 1X+27.064，r=0.999 1，線性范圍:26～420 ng。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取同一濃度的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，馬錢(qián)苷平均峰面積RSD為1.27%，結(jié)果表明:儀器精密度良好，符合體內(nèi)藥物濃度測(cè)定的要求。

2.6.4 回收率試驗(yàn) 按2.3項(xiàng)下方法制備不同濃度含藥血清標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)測(cè)定，不同濃度下均有高而穩(wěn)定的回收率，各濃度回收率符合體內(nèi)藥物濃度測(cè)定的要求，RSD為4.01%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白血清，加入適量標(biāo)準(zhǔn)品，配置成終濃度為55.0 μg/mL馬錢(qián)苷血清樣品，分別于 2、4、6、8、24 h 分別進(jìn)樣分析 1 次，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算RSD(變異系數(shù))值，RSD=0.55%，表明:血清樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 大鼠灌胃后，分別于不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定馬錢(qián)苷的血藥濃度。采用3P97藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行自動(dòng)擬合處理。以理論血藥濃度值與實(shí)際測(cè)定值的相關(guān)系數(shù)最大和AIC最小作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，權(quán)重1/C。結(jié)果馬錢(qián)苷的藥動(dòng)學(xué)曲線經(jīng)擬合符合一室模型，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3，平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。

表3 灌胃給藥后馬錢(qián)苷的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

圖2 平均血藥濃度-時(shí)間曲線(n=6，±s)

3.1 馬錢(qián)苷為2010版《中國(guó)藥典》收載的六味地黃丸指標(biāo)成分之一，近年來(lái)對(duì)六味地黃丸中馬錢(qián)苷的研究較多［3-7］，但大多集中在體外成分含量測(cè)定方面，其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究鮮有報(bào)道。本研究在體外研究的基礎(chǔ)上，采用反相高效液相色譜法測(cè)定大鼠血清中馬錢(qián)苷的濃度，研究大鼠灌胃給藥后的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，這對(duì)臨床合理用藥及劑型的改進(jìn)都將具有一定的指導(dǎo)意義。

3.2 本研究以血藥濃度法作為手段，采用高效液相色譜技術(shù)，在參考有關(guān)文獻(xiàn)［7］的基礎(chǔ)上建立了適合本研究的色譜條件和血清樣品制備方法。通過(guò)比較空白血清、空白血清加馬錢(qián)苷對(duì)照品、六味地黃丸含藥血清以及六味地黃丸含藥血清加馬錢(qián)苷對(duì)照品的色譜圖，可很好地對(duì)六味地黃丸含藥血清中的馬錢(qián)苷進(jìn)行定性分析;且能將大鼠血清中目標(biāo)成分與血清中蛋白雜峰、內(nèi)源性物質(zhì)、六味地黃丸的其他成分以及這些成分的體內(nèi)代謝產(chǎn)物和結(jié)合性成分很好分離。此方法重現(xiàn)性好，操作程序簡(jiǎn)便，為相關(guān)制劑中馬錢(qián)苷的入血分析提供參考。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器，在分析時(shí)進(jìn)行200～400 nm紫外掃描，確定馬錢(qián)苷在236 nm有最大吸收，故選用236 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 色譜條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中考察了不同系統(tǒng)的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫篩選試驗(yàn)，包括:①乙腈-水溶液②甲醇-水溶液③乙腈-0.05%磷酸水溶液④甲醇-0.05%磷酸水溶液多個(gè)梯度洗脫系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行考察。結(jié)果表明:乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫系統(tǒng)最佳，色譜峰峰型好，各色譜峰分離度高，保留時(shí)間適宜，故選用該流動(dòng)相系統(tǒng)作為六味地黃丸含藥血清含量測(cè)定的洗脫系統(tǒng)。

3.5 由于中藥復(fù)方所含成分的復(fù)雜性，口服后有效成分含量偏低，經(jīng)制劑處理，服用時(shí)胃腸道的選擇性吸收及肝臟的首過(guò)效應(yīng)等原因，其在血液中的含量大大減少，經(jīng)HPLC分析時(shí)難以檢出，故本研究采用肝門(mén)靜脈采血法，因?yàn)榻?jīng)肝門(mén)靜脈采血具有原型入血成分血藥濃度較高(藥物經(jīng)消化道吸收，尚未被肝臟代謝)、操作簡(jiǎn)便、清潔衛(wèi)生等優(yōu)點(diǎn)，從而確保目標(biāo)成分的檢出。

3.6 由于考慮到血清沉淀蛋白及過(guò)濾進(jìn)樣消耗量大，所以選用大鼠單次采血，這樣能保證分析的正常進(jìn)行，但缺點(diǎn)是會(huì)造成個(gè)體差異誤差較大，本實(shí)驗(yàn)選用多個(gè)樣本重復(fù)求平均值的方法減小誤差。

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