安 叡， 姚亞敏， 王新宏

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203;2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海201508)

葛根芩連湯為東漢醫(yī)圣張仲景名方，出自《傷寒論·太陽篇》，由葛根、黃芩、黃連、炙甘草四味中藥組成，有解表清里，升陽止瀉功效，用于瀉熱下利［1］。指紋圖譜作為控制中藥復(fù)方質(zhì)量的重要而有效的手段，與中藥復(fù)方有效成分的復(fù)雜性、不確知性，以及發(fā)揮作用時(shí)眾多成分的協(xié)同性、多靶點(diǎn)性特點(diǎn)相吻合［2］。但僅通過色譜方法得到的中藥樣品色譜圖應(yīng)該僅為樣品的化學(xué)輪廓圖，必須通過一定的數(shù)據(jù)處理和多個(gè)相關(guān)樣品比較，指紋峰的歸屬鑒別等后才可以賦予色譜圖以特征性。本研究采用梯度洗脫技術(shù)進(jìn)行HPLC分離分析，建立葛根芩連湯的數(shù)字化色譜指紋譜，并分別對方中葛根、黃芩、黃連進(jìn)行色譜指紋譜鑒別，探求各藥材所呈現(xiàn)的特征峰群，建立復(fù)方與藥材化學(xué)組成之間的聯(lián)系，有助于提高中藥復(fù)方質(zhì)量控制水平。希望為闡明葛根芩連湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從化學(xué)成分分析其配伍規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(G1379A Degasser;G1311A Quantum;G1316A Column;G1314A Vwd);SK3200H超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

葛根、黃芩、黃連和炙甘草藥材均購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，經(jīng)本校趙志禮教授鑒定。

葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品(批號分別為110752-200511、111738-200501、111502-200101、 110715-200815、111595-200604、 111514-200403、 110713-200609、 110732-200506)均購自中國藥品生物制品檢定所;漢黃芩苷，批號061013;購自上海友思生物技術(shù)有限公司。

甲醇(HPLC級購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甲酸、三乙胺等試劑為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-含0.5%甲酸和0.5%三乙胺的水溶液;梯度:在0～90 min內(nèi)甲醇從26%線性升至70%;流速:1 mL/min;檢測波長:270 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 復(fù)方供試品溶液的制備 按處方配比精密取葛根芩連湯各味藥飲片(葛根約15 g，黃芩約9 g，黃連約9 g，甘草約6 g)，加10倍量水煎煮45 min，濾過，再加8倍量水煎煮30 min，減壓回收干燥，得提取物。取提取物約0.5 g，精密稱定，加甲醇25 mL，超聲提取后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，得復(fù)方供試品溶液。

2.2.2 藥材供試品溶液的制備 按處方量各取葛根、黃芩、黃連藥材，精密稱定，按復(fù)方相同制備方法處理，得各藥材提取物，取葛根藥材提取物約2 mg、黃芩藥材提取物約1 mg、黃連藥材提取物約1 mg，精密稱定，各加甲醇10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，得各藥材供試品溶液。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備 稱取除某味藥材的陰性處方，按復(fù)方相同制備方法處理，得各陰性樣品提取物，各取葛根、黃芩、黃連陰性提取物約3 mg，精密稱定，加甲醇10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，得各陰性供試品溶液。

2.2.4 對照品溶液配制 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥48 h的各對照品適量，用甲醇溶解并定容，制備各對照品的單標(biāo)對照品溶液:葛根素濃度為0.35 mg/mL、大豆苷濃度為0.13 mg/mL、大豆苷元濃度為1.02 mg/mL、黃芩苷濃度為0.0712 mg/mL，漢黃芩苷濃度為0.18 mg/mL，黃芩素濃度為0.36 mg/mL，漢黃芩素濃度為0.14 mg/mL，鹽酸小檗堿濃度為0.46 mg/mL，鹽酸巴馬汀濃度為0.52 mg/mL，備用。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 對照品的檢出 在確定的色譜條件下對葛根芩連湯中的葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀均能檢出，峰形均較理想(見圖1)。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各組分的保留時(shí)間和峰面積，各組分保留時(shí)間的RSD均小于0.71%，各組分峰面積的RSD均小于0.58%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24、36 h在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄各組分的保留時(shí)間和峰面積，各組分保留時(shí)間的RSD均小于1.29%，各色譜峰峰面積的RSD均小于0.98%，結(jié)果表明供試品溶液在36h內(nèi)穩(wěn)定(見圖2)。

圖1 葛根芩連湯HPLC圖中對照品的檢出

圖2 不同時(shí)間間隔測定所得HPLC圖

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按處方配比取葛根芩連湯各味藥飲片，各取5份，按2.2.1項(xiàng)方法制備樣品，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄各組分的保留時(shí)間和峰面積，各組分保留時(shí)間的RSD均小于1.41%，各組分峰面積的 RSD均小于1.71%，結(jié)果表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.4 HPLC相對保留值指紋譜的建立 本研究采用HPLC技術(shù)對葛根芩連湯及葛根、黃芩、黃連藥材一次進(jìn)樣進(jìn)行梯度分離分析，得到眾多的色譜峰(見圖3～5)，利用相對保留值(α)及樣品峰相對面積值(RA)組成各樣品的HPLC數(shù)字化色譜指紋譜(HPLC-FPS)［3-6］，通過與陰性樣品比較，可找出葛根芩連湯中用以鑒定上述藥材的較全面的特征峰群，實(shí)現(xiàn)對制劑中藥材的鑒定。表1為以葛根素為內(nèi)參照峰的葛根藥材及樣品的色譜指紋譜的特征峰;表2為以黃芩苷為內(nèi)參照峰的黃芩藥材及樣品的色譜指紋譜的特征峰;表3為以鹽酸小檗堿為內(nèi)參照峰的黃連藥材及樣品的色譜指紋譜的特征峰。

表1 葛根藥材在樣品中的特征峰

表2 黃芩藥材在樣品中的特征峰

表3 黃連藥材在樣品中的特征峰

圖3 葛根芩連湯、葛根藥材及陰性樣品HPLC圖

圖4 葛根芩連湯、黃芩藥材及陰性樣品HPLC圖

圖5 葛根芩連湯、黃連藥材及陰性樣品HPLC圖

2.5 結(jié)果 在葛根芩連湯指紋譜中均能找到葛根、黃芩和黃連藥材的特征峰群，其中 α 值為0.482、0.612、0.664、1.000、1.080、1.187、1.375、1.478、1.617、2.397 和 3.404(以葛根素為內(nèi)參照峰)為葛根藥材的特征峰群;α值為0.633、0.753、1.000、1.070、1.147、1.179、1.232、1.279、1.595、1.884和1.998(以黃芩苷為內(nèi)參照峰)為黃芩藥材的特征峰群;α 值為 0.132、0.292、0.438、0.645、0.798、0.879、1.000、1.040、2.935和2.986(以鹽酸小檗堿為內(nèi)參照峰)為黃連藥材的特征峰群。結(jié)果表明所建立的數(shù)字化色譜指紋譜中可找出用以鑒定各藥材的較全面的特征峰群，可實(shí)現(xiàn)對復(fù)方中中藥材的鑒定。

3 討論

葛根芩連湯中成分復(fù)雜，含有多種生物堿、黃酮類、皂苷類成分，方中的黃酮類和生物堿類物質(zhì)分別進(jìn)行反相高效液相色譜分析時(shí)所適用的流動(dòng)相條件差別較大。本研究考察了甲醇-水，甲醇-0.5%甲酸，甲醇-水(含0.5%甲酸和0.5%三乙胺)以及乙腈-水(含0.5%甲酸和0.5%三乙胺)等流動(dòng)相對樣品組分分離的影響，確定了最佳流動(dòng)相配比。同時(shí)比較了在 210，220，250，270，280，346，365 nm 不同檢測波長下的圖譜，結(jié)果顯示在270nm波長下，峰數(shù)目較多，各峰高低比例適宜，且基線平穩(wěn)。建立的色譜條件可實(shí)現(xiàn)弱酸性和弱堿性物質(zhì)同時(shí)分析，且在很大程度上解決了弱酸性和弱堿性物質(zhì)共存時(shí)，弱堿性物質(zhì)峰形差的問題。

藥材來源的峰在復(fù)方中的表達(dá)可以劃分一定的指紋區(qū)域，其中5～20 min主要來自葛根，20～35 min主要來自黃連，35～70 min主要來自黃芩，直觀的指紋圖譜是評價(jià)、控制中成藥質(zhì)量的有效方法，也是中藥研究的一種模式。但這樣的方法有一定誤差且無量化指標(biāo)。目前由于對照品有限，不能較全面地對指紋圖譜中的主要色譜峰一一定性，本研究通過分析復(fù)方、待鑒藥材和陰性樣品的數(shù)字化色譜指紋譜，找到了葛根、黃芩和黃連的特征峰群，可用于復(fù)方中上述藥味的鑒別，這也為今后葛根芩連湯化學(xué)配伍研究奠定了基礎(chǔ)。

通過對所建立的數(shù)字化色譜指紋譜分析，發(fā)現(xiàn)在全方中保留時(shí)間為57.285、81.309、88.250 min為葛根、黃芩和黃連藥材及各自的陰性樣品中均未檢測到的;提示上述成分為復(fù)方形成過程中產(chǎn)生的新成分，為進(jìn)一步深入研究上述問題，需在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，設(shè)計(jì)不同配伍的藥味在確定色譜條件下分析，建立相應(yīng)的數(shù)字化色譜指紋譜進(jìn)行更為深入地研究，如能結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)，則有望搞清指紋譜中相關(guān)成分的結(jié)構(gòu)，從而為闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

本研究在確定的色譜條件下對炙甘草進(jìn)行如上述藥材的鑒定，結(jié)果不理想，炙甘草藥材出峰非常少，在全方中只檢出了保留時(shí)間為20.896 min處的甘草苷，含量非常低，未檢測到甘草酸。筆者將炙甘草單獨(dú)用甲醇提取后在確定色譜條件分析，可檢出成分較在全方中多，分析原因可能是全方水煎后引起炙甘草中成分變化，有文獻(xiàn)報(bào)道葛根芩連湯中黃連可降低其中甘草酸含量［7］。

［1］李順保.傷寒論版本大全［M］.北京:學(xué)苑出版社，2001.

［2］劉 斌，石任斌，朱麗君，等.苦參湯黃酮類成分HPLC指紋圖譜及其與組方藥味黃芩和苦參的相關(guān)性研究［J］.中國中藥雜志，2007，32(16):1631.

［3］洪筱坤.中藥數(shù)字化色譜指紋譜［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2003.

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