康四和， 周 銳， 聶 晶

(湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢430064)

小兒消積止咳口服液由山楂、檳榔、枳實(shí)、枇杷葉等藥味組成，具有清熱理肺、消積止咳等作用，為山東魯南厚普制藥有限公司生產(chǎn)小兒用藥，原標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC法測(cè)定枳實(shí)中辛弗林的含量。據(jù)文獻(xiàn)［1］報(bào)道，橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等黃酮類成分是枳實(shí)中主要的活性成分，能抑制胃腸平滑肌收縮，緩解胃腸積滯。對(duì)枳實(shí)中橙皮苷、柚皮苷等成分研究文獻(xiàn)有報(bào)道［2-4］，但同時(shí)測(cè)定本品種中多種黃酮類成分含量，文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定小兒消積止咳口服液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量。同時(shí)為了評(píng)價(jià)本品種不同批次樣品質(zhì)量差異，本實(shí)驗(yàn)對(duì)多批樣品測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較，具體實(shí)驗(yàn)方法如下:

1 儀器與試藥

戴安Ultimate-3000高效液相色譜儀;大連依利特Hypersil ODS2液相色譜柱(200 mm×4.6mm;5μm);柚皮苷、橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):柚皮苷 110722-200610，橙皮苷110721-200613)，新橙皮苷對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào):091225);乙腈為色譜純，水為重蒸水;其他試劑為分析純;小兒消積止咳口服液(山東魯南厚普藥業(yè)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:大連依利特Hypersil ODS2色譜柱(200 mm×4.6 mm;5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80);檢測(cè)波長(zhǎng):λ=283 nm;流速:1 mL/min;柱溫:35℃。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，在紫外檢測(cè)儀上于200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷分別在283 nm、284 nm、284 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，依據(jù)參考文獻(xiàn)［5］，選擇 λ283 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷0.4 mg、橙皮苷0.1 mg、新橙皮苷0.4 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品，精密吸取1 mL，加甲醇至10 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性干擾試驗(yàn) 取不含枳實(shí)的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備，依法測(cè)定，結(jié)果陰性樣品在柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰相應(yīng)的位置上無(wú)吸收峰，表明其他藥對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品、樣品和陰性樣品HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷0.421 mg、橙皮苷0.102 2 mg、新橙皮苷0.440 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。分別精密吸取1、3、5、8、10、20 μL，注入高效液相儀，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程:柚皮苷 Y=235.963 8X+4.603 7，r=0.999 0。橙皮苷 Y=321.514 1X+0.099 0，r=0.999 9。新橙皮苷 Y=272.508 4X+2.889 8，r=0.999 7。

結(jié)果表明柚皮苷對(duì)照品在0.042 1～0.842 μg、橙皮苷對(duì)照品在0.010 22～0.204 4 μg、新橙皮苷對(duì)照品在0.044 0～0.880 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取線性關(guān)系考察項(xiàng)下同一混合對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積積分值RSD分別為0.52%、1.07%、0.27%，具有較好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)09103025)，分別于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 各測(cè)定1次，結(jié)果柚皮苷RSD=1.00%，橙皮苷RSD=0.78%，新橙皮苷RSD=1.15%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密吸取同一批號(hào)(批號(hào)09103025)的樣品6份，每份1 mL，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，結(jié)果樣品中柚皮苷的平均含量為4.094 mg/mL，RSD=0.71%;橙皮苷的平均含量為0.680 mg/mL，RSD=0.67%;新橙皮苷的平均含量為4.194 mg/mL，RSD=0.76%。表明本法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)09103025)6份，每份0.5 mL，分別精密加入柚皮苷對(duì)照品(0.616 8 mg/mL)3 mL，橙皮苷對(duì)照品(0.157 0 mg/mL)2 mL，新橙皮苷對(duì)照品(0.754 4 mg/mL)3 mL，精密加入甲醇至10 mL，搖勻，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1～3。由表可知，本法具有較好的回收率。

2.10 樣品含量測(cè)定 取樣品，精密吸取1 mL，按2.3.2項(xiàng)制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各5 μL，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 化學(xué)成分是治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該品種20批樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果柚皮苷、新橙皮苷含量相對(duì)較高，平均分別為4.882 mg/mL、4.843 mg/mL，橙皮苷含量較低，平均為0.656 mg/mL。但部分批次含量差別較大，有的甚至超出均值一倍以上，說(shuō)明本品種在藥材來(lái)源、生產(chǎn)工藝等方面有待加強(qiáng)控制，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。

表1 柚皮苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 橙皮苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 新橙皮苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3.2 本實(shí)驗(yàn)曾采用甲醇—水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，結(jié)果樣品分離效果不太好。后改用乙腈—水—磷酸系統(tǒng)，能顯著的改善峰形，3種成分在同一色譜條件下較好地得到了分離，經(jīng)對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行調(diào)整，考慮到分離效果及出峰時(shí)間因素，最后確定流動(dòng)相為乙腈—0.1%磷酸溶液(20∶80)。

3.3 小兒消積止咳口服液原標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定方法為采用HPLC法測(cè)定枳實(shí)中辛弗林的含量，該方法操作較為復(fù)雜，測(cè)定成分單一，本實(shí)驗(yàn)建立了能夠同時(shí)測(cè)定樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種成分的含量測(cè)定方法，可以對(duì)本品種質(zhì)量進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)，體現(xiàn)了一法多測(cè)的分析理念。經(jīng)研究柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在所選用條件下分離較好，檢測(cè)靈敏度高，測(cè)定專屬性強(qiáng)，陰性無(wú)干擾，可以更好地控制和評(píng)價(jià)該品種的質(zhì)量。

［1］張尚英.枳實(shí)、枳殼類藥材質(zhì)量分析的新進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2004，16(5):13-14.

［2］李秀玲，李 龍，肖紅斌，等.反相高效液相法測(cè)定枳實(shí)、枳殼中橙皮甙和柚皮甙的含量［J］.色譜，2002，20(6):585-589.

［3］謝貞建，焦士蓉，李 愷，等.RP-HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地枳實(shí)中的柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷［J］.西華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，28(2):65-67.

［4］郭麗紅，鄭國(guó)鈞，苗愛(ài)東，等.高效液相色譜法測(cè)定解表清肺丸中柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29(9):1493-1495.

［5］中國(guó)藥典［S］.一部.2010:229.