劉新國(guó)， 周莉玲， 郭麗蓉

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

跌打止痛巴布劑是將蛇床子、獨(dú)活、川芎、大黃等七十七味中藥經(jīng)超臨界二氧化碳萃取后，加入丁香羅勒油、桂皮油等九味揮發(fā)油制成的水凝膠型膏貼劑，具有活血化瘀、消腫止血、行氣止痛、收斂生肌的功效，對(duì)治療跌打損傷、火傷燙傷、刀傷出血具有顯著的作用。本方成分復(fù)雜，藥味間相互干擾大，制劑質(zhì)量控制難度較大。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)貼膏劑下巴布劑制劑通則，結(jié)合跌打止痛巴布劑自身特點(diǎn)，采用薄層色譜法和氣相色譜法鑒別方中主要藥味，方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確可靠，可有效控制制劑質(zhì)量，為今后含揮發(fā)油膏貼劑型的研究及揮發(fā)性成分含量測(cè)定提供參考。

1 儀器與試藥

ZF－I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)，Agilent 6890N氣相色譜儀(安捷倫)及配套工作站，石英毛細(xì)管柱(phenomenex ZB－WAX，長(zhǎng) 30 m，內(nèi)徑 0.32 mm ，涂層 0.5 μm)。

蛇床子對(duì)照藥材(批號(hào)121030－200405)、獨(dú)活對(duì)照藥材(批號(hào)120940－200809)、川芎對(duì)照藥材(批號(hào)120918－200809)、大黃對(duì)照藥材(批號(hào) 120902－200609)、蛇床子素對(duì)照品(批號(hào) 110822－200406)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào) 110796－200716)、桉油精對(duì)照品(批號(hào) 110788－200903)、樟腦對(duì)照品(批號(hào) 747－200606)、薄荷腦對(duì)照品(批號(hào) 0728－00005)、異龍腦對(duì)照品(批號(hào) 1512－200201)、龍腦對(duì)照品(批號(hào) 110881－200202)、水楊酸甲酯對(duì)照品(批號(hào) 110707－200107)、茴香醛對(duì)照品(批號(hào) 1545－200001)、桂皮醛對(duì)照品(批號(hào) 110710－200714)、丁香酚對(duì)照品(批號(hào) 725－200209)，以上對(duì)照藥材與對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，萘(純度＞99%，sigma)，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

跌打止痛巴布劑(廣州敬修堂藥廠，批號(hào):081116、081117、081118，規(guī)格:10 cm ×6 cm，含膏量6 g/片)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 蛇床子、獨(dú)活鑒別

2.1.1.1 供試品溶液制備 取本品5片，剪成寬約1 cm條帶狀，揭去蓋襯，加甲醇150 mL，浸漬1 h，濾過，濾液濃縮至10 mL，殘液加水20 mL，用乙醚分兩次萃取，每次30 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL溶解，作為供試品溶液。

2.1.1.2 對(duì)照藥材溶液制備 取蛇床子、獨(dú)活對(duì)照藥材各0.3 g，分別加無水乙醇5 mL，超聲處理10 min，濾過，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.1.3 對(duì)照品溶液制備 取蛇床子素對(duì)照品，加無水乙醇制成1 mL含0.1 mg溶液。

2.1.1.4 陰性對(duì)照溶液制備 取缺蛇床子和獨(dú)活的陰性樣品，同蛇床子、獨(dú)活供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.1.5 照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn) 精密吸取上述4種溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷－甲苯－乙酸乙酯(2∶3∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

2.1.2 川芎薄層鑒別

2.1.2.1 供試品溶液制備 取本品10片，剪成寬約1 cm條帶狀，除去蓋襯，加甲醇300 mL，浸漬1 h，濾過，濾液濃縮至20 mL，殘液加乙醚100 mL，置水浴上回流提取兩次，每次30 min，合并乙醚層，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL溶解，作為供試品溶液。

2.1.2.2 對(duì)照藥材溶液制備 取川芎對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇25 mL，超聲處理10 min，濾過，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液。

圖1 蛇床子素的薄層鑒別

2.1.2.3 陰性對(duì)照溶液 取缺川芎的陰性樣品，同川芎鑒別供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.2.4 精密吸取上述3種溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯(6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置，顯現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，見圖2。

圖2 川芎的薄層鑒別

2.1.3 大黃薄層鑒別

2.1.3.1 供試品溶液制備 取本品10片，剪成寬約1 cm條帶狀，除去蓋襯，加甲醇300 mL，浸漬1 h，濾過，濾液濃縮至20 mL，殘液加水90 mL，再加鹽酸9 mL，置水浴上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚分兩次萃取，每次150 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3.2 對(duì)照藥材溶液制備 取大黃對(duì)照藥材0.2 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾液揮干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚分兩次萃取，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3.3 對(duì)照品溶液制備 取大黃酚對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3.4 陰性對(duì)照溶液制備 取缺大黃的陰性樣品，同大黃鑒別供試品溶液制備方法處理，制成大黃陰性對(duì)照溶液。

2.1.3.5 精密吸取上述4種溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G板上，以正己烷－乙酸乙酯(6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣飽和展開槽中顯色至斑點(diǎn)清晰，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，見圖3。

圖3 大黃的薄層鑒別

2.1.4 薄層鑒別方法耐用性考察

2.1.4.1 不同薄層板的比較 以上3個(gè)薄層鑒別試驗(yàn)，以羧甲基纖維素鈉為黏合劑手鋪硅膠G薄層板鑒別效果均優(yōu)于預(yù)制硅膠G板。

2.1.4.2 不同濕度的比較 取點(diǎn)樣后的薄層板分別于濕度22%和75%的層析缸中展開，顯色，檢視。結(jié)果表明在相對(duì)濕度22%～75%之間，鑒別效果均無明顯變化。

2.1.4.3 不同溫度的比較 取點(diǎn)樣后的薄層板分別在4℃和30℃條件下展開，顯色，檢視。結(jié)果表明在4℃ ～30℃溫度范圍內(nèi)對(duì)鑒別效果均無明顯影響。

2.2 氣相色譜鑒別

2.2.1 混合對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取桉油精、樟腦、薄荷腦、異龍腦、龍腦、水楊酸甲酯、茴香醛、桂皮醛、丁香酚對(duì)照品適量，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 取萘適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密量取混合對(duì)照品貯備液和內(nèi)標(biāo)溶液各250 μL，至10 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 供試品溶液 取跌打止痛巴布劑5片(含藥膏30 g)，剪成1 cm寬小條，去除蓋襯，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，連接揮發(fā)油提取器，自提取器上端加水使充滿刻度，并溢流入燒瓶為止。連接回流冷凝管，加熱回流5 h，放冷，分取油層，用鋪有無水硫酸鈉的漏斗濾過，精密稱定重量。從中精密稱取揮發(fā)油100 μg，加入內(nèi)標(biāo)溶液250 μL，無水乙醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

2.2.5 陰性對(duì)照溶液制備 取缺桉油、樟腦、薄荷油、冰片、水楊酸甲酯、八角茴香油、桂皮油、丁香羅勒油的陰性樣品，按供試品溶液相同方法處理，制成溶液。

2.2.6 色譜條件 以石英毛細(xì)管柱為色譜柱，柱溫為程序升溫，80℃保持2min后開始升溫，以5℃/min升溫至140℃，保持8 min，再以12℃/min升溫至220℃;進(jìn)樣口溫度為210℃;檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，溫度為245℃;載氣為高純氮?dú)?，流?1 mL/min;進(jìn)樣量為1 μL;分流比40∶1;理論板數(shù)按丁香酚峰計(jì)算不低于50 000。

按上述色譜條件，分別取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液1μL進(jìn)樣測(cè)定，采用相對(duì)保留值法進(jìn)行色譜峰的指認(rèn)。從結(jié)果可以看出，各指標(biāo)峰之間分離良好，供試品溶液相對(duì)保留時(shí)間與對(duì)照品溶液相對(duì)保留時(shí)間出現(xiàn)相應(yīng)特征峰，陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖4～圖6。

圖4 供試品溶液色譜圖

圖5 混合對(duì)照品溶液色譜圖

3 討論

3.1 按2005版《中國(guó)藥典》收載大黃藥材薄層鑒別項(xiàng)目，365 nm紫外光下應(yīng)檢視到五個(gè)暗紅色斑點(diǎn)，按Rf值從小到大依次為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚。而跌打止痛巴布劑所采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)主要是針對(duì)極性較小成分進(jìn)行萃取，薄層色譜圖中雖未發(fā)現(xiàn)大黃酚以外大黃成分，但鑒別結(jié)果并無干擾，且試驗(yàn)結(jié)果與采用《中國(guó)藥典》大黃鑒別方法所得結(jié)果一致，因此采用上述方法鑒別方中大黃成分還是可行的。

圖6 陰性對(duì)照溶液色譜圖

3.2 在揮發(fā)性成分氣相色譜鑒別過程中，供試品溶液制備曾采用甲醇冷浸法提取，提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后直接作為供試品溶液。但這種浸提方法所得供試液體積大，雜質(zhì)成分多，巴布劑基質(zhì)中甘油也被一并提出，影響色譜柱壽命，給氣相分離帶來很大困難，故未予采用。

3.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇，曾嘗試用正十六烷、環(huán)己酮作內(nèi)標(biāo)，由于色譜峰分離效果和保留時(shí)間差異等原因未予采用。

本研究不僅在同一氣相色譜條件下鑒別出跌打止痛巴布劑中多個(gè)揮發(fā)性成分，更重要是為外用膏貼劑中揮發(fā)性成分含量測(cè)定提供合適的內(nèi)標(biāo)物和方法學(xué)的參考。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:附錄57.

［2］孟 舒，陳再興，姜 泓，等.玄丹巴布劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2007，24(5):394－396.