林 彤， 成 琳

(廣州市藥品檢驗所，廣東廣州510160)

蓮芝消炎膠囊由穿心蓮和山芝麻兩味藥材經(jīng)提取制成，具有清熱，解毒，消炎之功效，用于腸胃炎，支氣管炎，扁桃體炎，咽喉炎，肺炎等。該品種為國家二級中藥保護品種，其質(zhì)量標準收載于中華人民共和國衛(wèi)生部《藥品標準》中藥成方制劑第十二冊［1］。原標準有山芝麻和穿心蓮的薄層色譜鑒別及采用滴定法測定穿心蓮總內(nèi)酯的含量。由于含量測定方法操作繁瑣，專屬性差以及原山芝麻薄層色譜鑒別陰性對照有干擾等原因，本實驗對山芝麻和穿心蓮的薄層色譜鑒別及穿心蓮含量測定方法進行了修訂，改用高效液相色譜法測定穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，有效地控制該品種的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

島津LC-10ATvp高效液相色譜儀;二極管陣列檢測器;Millipore Milli-Q純水器;Mettler Toledo萬分之一、十萬分之一及百萬分之一電子天平。

脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品:(批號:0854-200204，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所提供)。

穿心蓮內(nèi)酯對照品:(批號:0797-200106，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所提供)。

甲醇為色譜純，水為超純水，中性氧化鋁(層析用，200～300目，上海新誠精細化工有限公司，批號:200108)，其余試劑均為分析純。

蓮芝消炎膠囊(批號:C25076;C27006;C27008;C27009;20050806;20051002;20060101;20060104;050309;051103)，由廣州白云山光華制藥股份有限公司、廣東省惠州九惠制藥廠和廣東省惠州市中藥廠提供。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 山芝麻 取本品4粒，傾出內(nèi)容物，用60%乙醇10 mL溶解，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加入乙酸乙酯振搖提取兩次，每次15 mL，分取乙酸乙酯液，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取山芝麻對照藥材3g，用60%乙醇50 mL加熱回流1 h，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(15∶2∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%硫酸鈰的10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱5 min，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。

本次修訂過程中增加了山芝麻陰性對照，結果顯示按原標準方法山芝麻陰性對照有干擾。參考文獻［2］比較了不同展開劑和顯色劑的薄層色譜效果，優(yōu)選出色譜條件如上所述，顯示展開效果較好，山芝麻特征斑點Rf值適中，山芝麻陰性對照無干擾，供試品薄層色譜中與山芝麻對照藥材主斑點基本一致，見圖1。

圖1 山芝麻的薄層鑒別色譜圖(修訂后的方法)

2.1.2 穿心蓮 取穿心蓮葉對照藥材0.5 g，加乙醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至約5 mL，作為對照藥材溶液。另取脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005版一部附錄ⅥB)試驗，吸取［含量測定］項下的供試品溶液8 μL、對照藥材溶液8 μL及對照品溶液4 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(4∶3∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點;噴以2%3，5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-2 mol/L氫氧化鉀溶液(1∶1)混合溶液(臨用時配制)，立即在日光下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

參照《中國藥典》2005年版一部“穿心蓮片”的薄層鑒別方法［3］549-550作了修改，以脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品作對照，采用穿心蓮葉對照藥材以增加該鑒別的專屬性。部分供試品溶液在與穿心蓮對照藥材色譜相應的位置上，只顯脫水穿心蓮內(nèi)酯斑點而未顯穿心蓮內(nèi)酯的斑點。這是由于穿心蓮內(nèi)酯對熱不穩(wěn)定，高溫干燥時部分轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮內(nèi)酯［4］，因而采用高溫濃縮干燥(減壓干燥)工藝制得的成品，其供試品薄層色譜中脫水穿心蓮內(nèi)酯斑點清晰而穿心蓮內(nèi)酯斑點不明顯(穿心蓮內(nèi)酯的有無在HPLC含量測定中將得到進一步確證)，采用低溫干燥(浮化床干燥)工藝則均顯示有脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯斑點。穿心蓮干浸膏陰性對照無干擾，薄層色譜圖見圖2。

2.2 穿心蓮含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取穿心蓮內(nèi)酯對照品、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含8 μg和50 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，室溫浸泡1 h，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL(剩余濾液供［鑒別］用)，置中性氧化鋁柱(200～300目，3 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖2 穿心蓮的薄層鑒別色譜圖

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱:DiamonsilTM鉆石 C18(200 mm × 4.6 mm，5 μm)No:8022889;柱溫:40 ℃;流動相:甲醇-水(60 ∶40)，流速:1 mL/min;穿心蓮內(nèi)酯檢測波長為225 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測波長為254 nm。理論板數(shù)按脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計算應不低于6 000，供試品液相色譜圖見圖3～6。

圖3 穿心蓮內(nèi)酯HPLC色譜圖

圖4 脫水穿心蓮內(nèi)酯HPLC色譜圖

2.2.4 專屬性 精密稱取缺穿心蓮干浸膏的模擬樣品0.2g，按含量測定方法制備供試液并進行測定，液相色譜圖見圖6，在與穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品色譜峰相應的位置上，未見有色譜峰，說明處方中的其他成分對測定不造成干擾。

圖5 蓮芝消炎膠囊供試液HPLC色譜圖(批號20060104)

圖6 穿心蓮干浸膏陰性HPLC色譜圖

2.2.5 線性 精密吸取穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液(0.15 mg/mL)0.5、1、3 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液①、②和③。精密吸取穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液①1、5 μL，對照品溶液②1、5、10、20、30 μL，對照品溶液③20、30 μL，進樣，依法測定，以穿心蓮內(nèi)酯的量 C(μg)為橫坐標，相應峰面積積分值A為縱坐標，繪制標準曲線，得線性方程:A=2 066 742.98C－1 052.04，r=0.999 997。結果表明穿心蓮內(nèi)酯在0.007 5～1.35 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

精密吸取脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液(0.05 mg/mL)2、5、10、20、30 μL，進樣，依法測定，以脫水穿心蓮內(nèi)酯的量C(μg)為橫坐標，相應峰面積積分值A為縱坐標，繪制標準曲線，得線性方程:A=1 618 179.68C －2 969.27，r=0.999 95。結果表明脫水穿心蓮內(nèi)酯在0.1～1.5 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.6 耐用性試驗

2.2.6.1 提取方法的選擇 參照《中國藥典》2005版一部“穿心蓮片”［含量測定］項下的方法，比較“精密量取續(xù)濾液10 mL置中性氧化鋁柱(200～300目，5 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置50 mL量瓶中”與“精密量取續(xù)濾液5 mL置中性氧化鋁柱(200～300目，3 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL量瓶中”所測得脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯的量，結果顯示兩種處理方法所得到的結果差異不大(見表1)，采用后一種方法可節(jié)省吸附劑和洗脫溶劑。在此基礎上再用甲醇20 mL或40%甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL量瓶中，按含量測定方法制備供試液并進行測定，未檢出穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯或所得含量極低，不影響定量結果，說明甲醇20 mL可基本洗脫完全，由此確立供試品溶液的制備方法如2.2.2項下方法。吸附劑用量比較見表1。

表1 吸附劑用量的比較

2.2.6.2 色譜柱的考察 方法中分別采用不同品牌的色譜柱測定樣品，結果見表2。

結果顯示，所選用的兩種色譜柱均達到方法系統(tǒng)適用性的要求，實際應用中還會使用其他不同品牌的色譜柱，未能一一考察，考慮到部分企業(yè)樣品的色譜圖中脫水穿心蓮內(nèi)酯峰旁還有一小雜質(zhì)峰，柱效降低時會并入脫水穿心蓮內(nèi)酯峰內(nèi)，影響定量，因此系統(tǒng)適用性試驗中以脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計算理論板數(shù)，定為不得低于6 000。

表2 兩種C18柱比較

2.2.6.3 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液(批號:20060104)，在室溫放置0、2、4、6、8、12 h 后分別進樣，依法測定，計算脫水穿心蓮內(nèi)酯平均含量為0.044 08 mg/mL，RSD 為2.1%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)測定結果基本穩(wěn)定。

取同一份供試品溶液(批號:20060104)，在室溫放置 0、1、2、3、5、6、8、9、15 h 后分別進樣，依法測定，計算穿心蓮內(nèi)酯平均含量為2.598 8 μg/mL，RSD為2.1%(n=9)，表明供試品溶液在15 h內(nèi)測定結果基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批號(批號:20060104)樣品，精密稱取6份，按2.2.2項制備供試液并進行測定。脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均含量為27.819 9 mg/g，RSD為2.3%(n=6);穿心蓮內(nèi)酯的平均含量為1.546 8 mg/g，RSD為2.3%(n=6)。

2.2.8 準確度(以加樣回收率表示) 取已知含量(批號:20060104)的樣品0.1 g，精密稱取6份，各精密加入脫水穿心蓮內(nèi)酯(23.103 mg/200 mL)對照品溶液25 mL，稱定重量，按2.2.2項下方法制備供試液，依法測定，計算回收率，結果見表3，平均回收率為99.1%，RSD為2.8%(n=6)。

表3 脫水穿心蓮內(nèi)酯回收率試驗結果

取已知含量(批號:20060104)的樣品0.1 g，精密稱取7份，各精密加入穿心蓮內(nèi)酯(1.411 mg/200 mL)對照品溶液25 mL，稱定重量，按2.2.2項下方法制備供試液，依法測定，計算回收率，結果見表4，平均回收率為99.8%，RSD為1.9%(n=7)。

表4 穿心蓮內(nèi)酯回收率試驗結果

2.2.9 樣品含量測定 取收集到的10批樣品，每批樣品平行取樣兩份，按2.2.2項下方法制備供試液，分別精密吸取對照品溶液10 μL，供試品溶液5～20 μL，注入液相色譜儀，測定，每份樣品平行測定兩次，計算供試品中脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯的含量，結果見表5。

表5 樣品含量測定結果(n=4)

3 討論

3.1 從10批樣品的測定數(shù)據(jù)可見，不同企業(yè)產(chǎn)品的含量差異較大，部分企業(yè)不同批次的樣品含量差異也較大，分析原因一方面穿心蓮葉藥材的質(zhì)量差異較大，各企業(yè)制備穿心蓮浸膏的設備不同，使原料中穿心蓮內(nèi)酯的總量差異較大;另一方面處方中穿心蓮總內(nèi)酯量是按穿心蓮干浸膏經(jīng)滴定法測定穿心蓮總內(nèi)酯的含量，換算成相當于穿心蓮總內(nèi)酯60 g投料，測定方法專屬性不強，滴定終點較難判斷，導致穿心蓮干浸膏投料量不夠準確，因此有必要建立專屬性強的方法取代滴定法。

3.2 《中國藥典》2005版一部“穿心蓮”藥材［3］189-190含量測定是在225 nm波長下測定穿心蓮內(nèi)酯的含量及在254 nm波長下測定脫水穿心蓮內(nèi)酯含量，以兩者的總量評價藥材的質(zhì)量。由于穿心蓮內(nèi)酯的熱不穩(wěn)定性，“穿心蓮片”制劑含量測定只在254 nm波長下測定脫水穿心蓮的含量。在制定本品種含量方法之初由于所收集的樣品中穿心蓮內(nèi)酯的量較低，與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量相差懸殊，因而只測定了成品中脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，隨后收集到部分廠家的樣品及穿心蓮干浸膏，發(fā)現(xiàn)由于采用不同的干燥設備所得穿心蓮干浸膏中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的比例有很大差異，采用低溫干燥(浮化床干燥)所得穿心蓮干浸膏中穿心蓮內(nèi)酯含量較高，脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量較低，采用高溫濃縮干燥(減壓干燥)則反之。提示穿心蓮內(nèi)酯對熱不穩(wěn)定，高溫干燥時部分轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮內(nèi)酯。因此最后建立同時測定脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯的含量，以兩者含量之和為評價指標較為客觀、合理。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部《藥品標準》中藥成方制劑［S］.第十二冊.1997:152.

［2］文東旭，馮 楓.山芝麻的薄層色譜鑒別研究［J］.廣西醫(yī)學，2003，25(12):2434-2435.

［3］中國藥典［S］.一部.2005.

［4］曾惠芳，黃曉丹，蘇子仁，等.試析穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的變異因素［J］.中藥新藥與臨床藥理，2006，17(4):299-301.