陳志鵬， 孫 俊， 劉 丹， 肖衍宇， 蔡寶昌*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210029;2.中國藥科大學(xué)，藥劑教研室，江蘇南京210009)

銀杏葉提取物(Ginkgo Biloba Extract，GBE)的主要活性成分為銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯［1］，現(xiàn)代藥理研究表明GBE對心血管系統(tǒng)有著廣泛而顯著的作用［2-4］，具有活血化瘀通絡(luò)的功效［5］。由于銀杏黃酮脂溶性低，小腸透過性差，生物利用度低，大大降低了臨床療效。文獻(xiàn)報(bào)道［6，7］，天然活性成分與磷脂分子間通過氫鍵等電荷遷移力作用可以形成磷脂復(fù)合物(phytosomes或 phospholipid complex)，其活性較原化合物有明顯的改善，可以有效地提高天然活性成分在體內(nèi)的吸收，顯著地增加其生物有效性。本課題組在前期研究中成功制備銀杏葉提取物磷脂復(fù)合物(Ginkgo biloba extract phospholipid complex，GBP)，體外研究表明，GBP能一定程度的改善其理化性質(zhì)，本研究以GBE為參比制劑，以槲皮素、山柰酚及異鼠李素為指標(biāo)性成分，進(jìn)一步研究GBP中GBE在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程，為中藥有效部位難溶性成分的開發(fā)提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試藥 槲皮素(批號100081-200406，純度 ＞98%)、山柰酚(批號110861-200405，純度 ＞98%)、異鼠李素(批號110860-200406，純度＞98%)均購自中國藥品生物制品檢定所;GBE(邳州富偉生化制品有限公司，含銀杏黃酮≥24%，銀杏內(nèi)酯≥6%);甲醇(色譜純)，磷酸(分析純)。

1.2 儀器 Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6(國華電器有限公司);渦漩混合器XH-C(金壇市醫(yī)療儀器廠);TGL-16臺式高速離心機(jī)(金壇市醫(yī)療儀器廠);METTLER TOLEDO AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.3 試驗(yàn)動物 ♂性SD大鼠12只，體重180～220 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供(合格證號:SYXK(蘇)2002-0008)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 GBP的制備 依據(jù)文獻(xiàn)［8］采用溶劑法制備GBP。取等量的GBE、磷脂，加入無水乙醇溶解，混勻，室溫下在磁力攪拌器攪拌2 h，40℃減壓干燥，真空干燥過夜即得。

2.2 體內(nèi)分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Hedera ODS-2柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流速:1 mL/min;檢測波長:370 nm;柱溫:30℃;流動相:甲醇-0.4%磷酸(60:40);進(jìn)樣量:20 μL。

2.2.2 血漿處理方法 取血漿樣品0.2 mL置10 mL離心管中，加入0.2 mL 25%HCl，80℃水浴加熱1 h，加入1 mL乙酸乙酯渦旋3 min，3 000 r/min離心10 min，吸取上層有機(jī)相，再加乙酸乙酯1 mL重復(fù)上述操作，合并兩次上層有機(jī)相，于50℃水浴上用氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL甲醇溶解，12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣。

2.2.3 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取槲皮素，山柰酚及異鼠李素對照品適量，用甲醇溶解稀釋成含槲皮素 40 μg/mL、山柰酚 31.2 μg/mL、異鼠李素20.8 μg/mL的混合溶液，再用甲醇稀釋成含槲皮素0.4、0.8、1.6、4、8、20、40 μg/mL，山柰酚 0.312、0.624、1.248、3.12、6.24、15.6、31.2 μg/mL，異鼠李素 0.208、0.416、0.832、2.08、4.16、10.4、20.8 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取160 μL空白大鼠血漿，分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液40 μL，分別得到槲皮素濃度為 0.08、0.16、0.32、0.8、1.6、5、8 μg/mL，山柰酚濃度為 0.062 4、0.124 8、0.249 6、0.624、1.248、3.12、6.24 μg/mL，異鼠李素濃度為0.041 6、0.083 2、0.166 4、0.416、0.832、2.08、4.16 μg/mL的血漿樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下操作，以血漿中槲皮素、山柰酚、異鼠李素濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 專屬性考察 空白血漿、空白血漿加混標(biāo)，大鼠灌胃GBE、GBP的血漿樣品分別按2.2.2項(xiàng)下操作，記錄色譜圖。

2.2.5 方法學(xué)考察 配制槲皮素濃度為0.08、0.8、8 μg/mL;山柰酚濃度為 0.0624、0.624、6.24 μg/mL;異鼠李素濃度為 0.041 6、0.416、4.16 μg/mL低、中、高3個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品5份，按2.2.2項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品濃度，同時將相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接進(jìn)樣，將經(jīng)過提取所得的色譜峰面積與未經(jīng)處理直接進(jìn)樣所得的色譜峰面積比較，計(jì)算絕對回收率。同樣配制上述三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定其日內(nèi)日間精密度。

2.3 藥物動力學(xué)試驗(yàn)

2.3.1 給藥方法 取大鼠12只，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，按20.3 mg/kg槲皮素、14.7 mg/kg山柰酚、3.2 mg/kg異鼠李素的劑量，A組灌胃GBE;B組灌胃GBP，并分別于給藥后10、20、30、45、60、90、120、240、360、480、600、720 min 經(jīng)眼眶取血置于涂有肝素的離心管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-20℃冷凍保存。按“2.2.2”項(xiàng)下操作后，用HPLC分析，將所得數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血漿藥物濃度。

2.3.2 藥物動力學(xué)參數(shù)計(jì)算 用3P97軟件對血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行房室模型進(jìn)行擬合，計(jì)算藥物動力學(xué)參數(shù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 分析方法的建立

3.1.1 方法專屬性 由圖1可見，在擬定色譜條件下，血漿樣品中槲皮素、山柰酚和異鼠李素與內(nèi)源性物質(zhì)分離良好，均達(dá)基線分離且無雜質(zhì)峰干擾。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線為:A=37 237c-1 383.1，r=0.998 7，表明槲皮素在0.08～8 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

山柰酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為:A=33 311c-1 226.4，r=0.999 2，表明山柰酚在0.062 4～6.24 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線為:A=18 803c-694.54，r=0.998 9，表明異鼠李素在0.041 6 ～4.16 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 A.空白血漿 B.含槲皮素(0.32 μg/mL)、山柰酚(0.249 6 μg/mL)及異鼠李素(0.166 4 μg/mL)的血漿標(biāo)準(zhǔn)品C.大鼠灌胃GBE后240 min的血漿樣品 D.大鼠灌胃GBP后240 min的血漿樣品 1.槲皮素2.山柰酚3.異鼠李素Fig.1 A.blank plasma B.blank plasma spiked with quercetin(0.32 μg/mL)，kaempferol(0.249 6 μg/mL)and isorhamnetin(0.166 4 μg/mL)C.plasma sample at 240 min after oral administration of GBE D.plasma sample at 240 min after oral administration of GBP.1.quercetin 2.kaempferol3.isorhamnetin

最低定量限分別為 0.056、0.048、0.039 μg/mL(S/N≥10)。

3.1.3 方法學(xué)考察 本檢測方法中，槲皮素、山柰酚、異鼠李素的平均回收率為82.14%、83.17%和82.96%，低、中、高3種濃度回收率結(jié)果見表1，低、中、高3種濃度槲皮素、山柰酚、異鼠李素的日內(nèi)、日間差都在10%以內(nèi)。符合生物樣本分析測試的要求。

3.2 藥動學(xué)研究

3.2.1 大鼠分別灌胃GBE和GBP后，槲皮素、山柰酚及異鼠李素血藥濃度-時間曲線見圖2。

表1 槲皮素、山柰酚及異鼠李素在大鼠血漿中的回收率(n=6)Table 1 Recovery of quercetin，kaempferol and isorhamnetin in rat plasma.(n=6)

圖2 大鼠口服GBE和GBP后槲皮素(A)、山柰酚(B)及異鼠李素(C)的血藥濃度經(jīng)時曲線(n=6)Fig.2 The plasma concentration-time curve of quercetin(A)，kaempferol(B)and isorhamnetin(C)in rats after oral administration of GBE and GBP(n=6)

3.2.2 藥物動力學(xué)參數(shù) 大鼠灌胃給予GBE和GBP后所得槲皮素、山柰酚及異鼠李素濃度數(shù)據(jù)用3P97軟件進(jìn)行房室模型擬合，以AIC為判據(jù)，得出槲皮素、山柰酚及異鼠李素在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程均符合一室模型，主要藥物動力學(xué)參數(shù)見表2。

4 討論

銀杏黃酮主要以槲皮素、山柰酚及異鼠李素及其與糖結(jié)合而成苷的形式存在，因此測定大鼠血漿中槲皮素、山柰酚，異鼠李素之前先對其苷元進(jìn)行水解。前期研究考察5個比較關(guān)鍵的水解因素，如:水解液中鹽酸的濃度，水解液的體積，水解溫度，水解時間以及萃取的次數(shù)，以樣品的回收率為指標(biāo)評價制備過程的可行性。最后得出最佳提取工藝，即往0.2 mL的血漿中加入等體積的25%HCl，在水浴中80℃加熱60 min后，3種苷元水解完全，回收率最高。此外，有報(bào)道用β-葡萄糖醛酸酶及硫酸酯酶水解血漿樣品［9］，但是兩者的價格均較昂貴，所以我們選擇了便宜又方便的鹽酸來水解樣品。前期研究中還比較液-液萃取法及蛋白質(zhì)沉淀法，發(fā)現(xiàn)液-液萃取法的回收率較高。對于萃取溶劑，我們考察了乙酸乙酯，氯仿以及乙醚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取的效果最好，故選擇乙酸乙酯作為我們的萃取溶劑。

表2 大鼠體內(nèi)槲皮素、山柰酚及異鼠李素主要藥動學(xué)參數(shù)(n=6)Table 2 The main pharmacokinetic parameters of quercetin、kaempferol and isorhamnetin in rats(n=6)

本實(shí)驗(yàn)通過研究大鼠灌胃GBE和GBP后，槲皮素、山柰酚及異鼠李素的藥物動力學(xué)特征及生物利用度，考察GBP的體內(nèi)行為。結(jié)果顯示，與GBE相比GBP生物利用度有顯著的提高，3種指標(biāo)性成分的AUC均提高2倍以上，此外，吸收速率常數(shù)和Cmax均有顯著的增加，顯示，制備成磷脂復(fù)合物后，GBP的吸收速率顯著高于GBE。

在研究中發(fā)現(xiàn)GBE的體內(nèi)存在明顯雙峰現(xiàn)象，推測是由于肝腸循環(huán)、胃腸循環(huán)或者是藥物在體內(nèi)的分布造成。馬越鳴［10］發(fā)現(xiàn)地西泮在體內(nèi)也存在雙峰現(xiàn)象，結(jié)果顯示其在體內(nèi)同時存在肝腸循環(huán)及胃腸循環(huán)，而胃腸循環(huán)是導(dǎo)致出現(xiàn)第二個峰的主要原因;也有報(bào)道黃芩苷在體內(nèi)存在存在雙峰的原因是肝腸循環(huán)［11］;有報(bào)道粉防己堿在大鼠體內(nèi)出現(xiàn)雙峰是歸結(jié)于它在體內(nèi)的分布［12］，而銀杏黃酮出現(xiàn)雙峰的原因有待于進(jìn)一步研究。

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