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        綿羊β3腎上腺素能受體基因多態(tài)性分析

        2010-01-30 01:32:38武建亮許登高喬利英劉文忠
        關(guān)鍵詞:廣靈綿羊等位基因

        武建亮,許登高,喬利英,劉文忠

        (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,太谷 030801)

        β3腎上腺素能受體 (beta-3 adrenergic receptor,ADRB3)是一種G蛋白耦聯(lián)的膜表面受體,屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族的成員之一。具有調(diào)節(jié)脂肪分解和能量消耗的作用,其生理功能主要是作用于脂肪組織,通過(guò)交感神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)刺激褐色脂肪組織和白色脂肪組織中的脂肪分解產(chǎn)生熱量[1]。在人類中ADRB3編碼的蛋白質(zhì)序列在64位點(diǎn)存在Trp64Arg突變,而Trp64Arg突變可減弱脂肪分解的活性[2],Trp64Arg多態(tài)性還與肥胖、2-型糖尿病、高血壓等癥狀有密切關(guān)系[3-4]。在綿羊ADRB3基因中,共檢出 13 種不同的基因型[5-6],ADRB3 多態(tài)性與羔羊的存活率、初生重和胴體組成都存在關(guān)聯(lián)效應(yīng)[7-9]。對(duì)ADRB3基因多態(tài)性的研究為綿羊分子育種體系的建立提供重要的科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料 本研究以12個(gè)綿羊品種(系)為研究對(duì)象,共采集962只個(gè)體的血液樣品。其中廣靈大尾羊(Guangling Fat-tailed sheep,GLT,n=35)、大尾寒羊(Fattailed Han sheep,LTH,n=22)、小尾寒羊(Small-tailed Han sheep,STH,n=146)、晉中綿羊(Jinzhong sheep,JZH,n=40)、山西肉用綿羊(Shanxi Dam Line,SDL,n=270)、山西細(xì)毛羊(Shanxi Fine-wooled sheep,SFW,n=40)、杜泊羊(Dorpor,DRP,n=45)、考力代羊(Corriedale,CRD,n=53)、特克塞爾羊 (Texel,TXL,n=38)、南非肉用美利奴羊(South Africa Mutton Merino,SMM,n=198)、陶賽特羊(Polled Dorset,DST,n=36)、德國(guó)肉用美利奴羊(German Mutton Merino,GMM,n=39)。

        1.2 方法

        1.2.1 基因組DNA的提取 采用酚-氯仿抽提法提取綿羊全基因組DNA。

        1.2.2 PCR-SSCP分析 根據(jù)GenBank公布的綿羊ADRB3基因序列(登錄號(hào):DQ269497),通過(guò)軟件Primer 5.0自行設(shè)計(jì)1對(duì)引物。引物序列為:Forward 5’-CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC-3’和 Reverse 5’-CCCAACTCCCAACCCGATC-3’,由上海英駿生物有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物為綿羊ADRB3基因部分內(nèi)含子序列,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為265 bp。PCR擴(kuò)增采用15 μL體系,PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min,35個(gè)循環(huán)(94℃變性30 s,63℃退火 30 s,72℃延伸 30 s),72℃延伸 10 min,4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入8 μL變性緩沖液,經(jīng)98℃熱變性10 min,立即置于冰上冰浴10 min,取10 μL經(jīng)過(guò)8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。電泳條件:4℃、120 V、5 W電泳12 h。采用硝酸銀染色法染色,凝膠成像系統(tǒng)成像后判斷帶型。

        1.2.3 克隆測(cè)序 通過(guò)PCR-SSCP檢測(cè)后挑選不同基因型的個(gè)體進(jìn)行克隆測(cè)序。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈割膠,用試劑盒純化回收后,用pMG-T載體連接試劑盒(北京天根)連接轉(zhuǎn)化,篩選陽(yáng)性克隆經(jīng)質(zhì)粒提取檢測(cè)后送北京諾塞基因有限公司測(cè)序。

        1.3 數(shù)據(jù)分析 用 Goudel(2001) 的 FSTAT(Version 2.9.3)軟件計(jì)算每個(gè)品種(系)該基因位點(diǎn)的等位基因頻率、等位基因豐度(rs)和基因多樣性(Hs)?;蚨鄻有缘挠?jì)算公式如下:

        式中,nk為第i個(gè)種群的個(gè)體數(shù),Pik為第k個(gè)種群中Ai的等位基因頻率,Hok為第k個(gè)種群的觀察雜合度。用Popgene 3.2軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)(Ne)。用MEGA 4.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果。由圖1可見(jiàn),引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致,擴(kuò)增條帶整齊、特異性強(qiáng)、產(chǎn)量高,結(jié)果理想,可用于后續(xù)研究。

        圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

        2.2 PCR-SSCP分析 對(duì)ADRB3基因5’端設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)265 bp,適合做SSCP分析。通過(guò)對(duì)12個(gè)品種(系)962個(gè)個(gè)體的PCR-SSCP檢測(cè),聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn),所研究綿羊的ADRB3基因在該擴(kuò)增片段上存在多態(tài)性,共檢測(cè)出 A、B、C、D、E、F、G 和 H 八種不同帶型,分別代表8種不同的基因型。

        圖2 綿羊ADRB3基因的PCR-SSCP結(jié)果

        2.3 綿羊ADRB3基因遺傳多態(tài)性分析

        2.3.1 等位基因頻率 在所檢測(cè)的ADRB3基因位點(diǎn)中有多態(tài)性,共檢測(cè)到8種等位基因。該基因片段的不同基因型在12個(gè)綿羊品種(系)中的頻率列于表1。在不同的綿羊品種(系)中所檢出的基因型也有所不同,基因型B和C在12個(gè)品種(系)中頻率較高,為優(yōu)勢(shì)基因型,基因型H只在南非肉用美利奴綿羊中檢出,為該綿羊品種特有的基因型。

        表1 各基因型在不同綿羊品種中的頻率

        2.3.2 有效等位基因數(shù)和等位基因豐度 就本研究中綿羊ADRB3基因位點(diǎn)而言,總?cè)后w有效等位基因數(shù)為2.240,等位基因豐度即獨(dú)立于樣本大小的等位基因數(shù)為6.515(表2)。有效等位基因數(shù)最多的為小尾寒羊,等位基因豐度最高的為廣靈大尾羊,有效等位基因數(shù)和等位基因豐度最小的種群均是山西細(xì)毛羊。

        2.3.3 基因多樣性 12個(gè)綿羊品種(系)中,ADRB3基因位點(diǎn)的基因多樣性范圍為0.050~0.729(表2),山西細(xì)毛羊的最小,小尾寒羊的最大,除山西細(xì)毛綿羊外,ADRB3基因在不同綿羊品種(系)中均表現(xiàn)出高度或中度多態(tài)性,具有較高的遺傳多樣性。

        2.4 綿羊ADRB3基因部分序列核苷酸變異 序列測(cè)定及比對(duì)結(jié)果表明,8種不同基因型中共包含10個(gè)SNPs,其中基因型A包含一個(gè)A堿基的插入。綿羊ADRB3基因部分序列核苷酸變異與基因型情況見(jiàn)表3。

        表2 不同綿羊品種(系)中有效等位基因數(shù)、等位基因豐度和基因多樣性無(wú)偏估計(jì)值

        表3 綿羊ADRB3基因部分序列核苷酸變異與基因型

        3 討論

        3.1 綿羊ADRB3基因多樣性 本研究通過(guò)PCR-SSCP對(duì)綿羊ADRB3基因多態(tài)性分析,共檢出8種不同的基因型,這與Byun等[5]對(duì)新西蘭綿羊檢測(cè)出8種基因型和Yang等[6]對(duì)中國(guó)藏系綿羊檢測(cè)出13種基因型的結(jié)果是相似的,都表明綿羊ADRB3基因存在較高的遺傳多樣性。而造成差異的原因可能是所研究的綿羊品種(系)不同而導(dǎo)致的,也可能是所選取的該基因序列片段不同而引起的。Forrest等[7-9]的研究表明,ADRB3 基因的不同基因型與羔羊的初生重、日增重、胴體組成以及羔羊的抗寒性存在著關(guān)聯(lián)效應(yīng)。因此基于ADRB3多態(tài)性與綿羊不同的生長(zhǎng)、生產(chǎn)性能之間的關(guān)聯(lián)性應(yīng)該進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

        3.2 綿羊遺傳資源的保護(hù) 從前人的研究和本實(shí)驗(yàn)的研究來(lái)看,山西地方綿羊品種相對(duì)來(lái)說(shuō)具有豐富的遺傳資源,是人類寶貴的基因庫(kù),應(yīng)該加以保護(hù)和利用[10-11]。本研究對(duì)ADRB3基因的遺傳多樣性檢測(cè),為我國(guó)綿羊的地方品種遺傳資源提供了一些依據(jù)。就山西地方綿羊品種而言,晉中綿羊和廣靈大尾羊的基因多樣性值均大于0.5,表明其遺傳多樣性較為豐富,而山西細(xì)毛羊的基因多樣性值僅為0.05,說(shuō)明其遺傳多樣性貧乏,應(yīng)該給予重視,加以保種。尤其是隨著畜禽品種雜交改良的開(kāi)展,大量國(guó)外優(yōu)良高產(chǎn)品種的引入以及近年來(lái)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整等因素的影響,晉中綿羊和廣靈大尾羊也不可避免地受到?jīng)_擊,如果不及時(shí)對(duì)晉中綿羊和廣靈大尾羊進(jìn)行品種特性研究和保護(hù),晉中綿羊和廣靈大尾羊?qū)⒅氐肝覈?guó)其它瀕危或已滅絕的地方家畜品種的覆轍。從生物遺傳多樣性和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的角度來(lái)看,對(duì)該品種的保護(hù)已刻不容緩。

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