張維秋,潘渭涓,陳 祥,耿士忠,黃金林,潘志明,焦新安

(揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室,江蘇揚州 225009)

禽源大腸埃希菌質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測*

張維秋,潘渭涓,陳 祥,耿士忠,黃金林,潘志明,焦新安*

(揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室,江蘇揚州 225009)

從我國部分地區(qū)病、死家禽中分離到大腸埃希菌403株。按照CLSI(clinical and laboratory standards institute)推薦的K-B藥敏紙片法對其中的344株分離株進行藥敏紙片試驗;根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列,設計并合成了五對引物,對所有分離細菌進行質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥基因的擴增:qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib-cr和qepA。1993年-1996年禽源大腸埃希菌分離株僅對萘啶酸的耐藥率超過60%;2001年-2008年禽源大腸埃希菌分離株對1-3代7種喹諾酮類藥物的耐藥率均超過58%。在403株禽源大腸埃希菌中共檢出3(0.7%)株qnrB陽性菌株,2(0.5%)株qnrS陽性菌株,5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr陽性菌株以及5(1.2%)株qepA陽性菌株,未檢測到qnrA陽性菌株。結果顯示,近20年來,我國禽源大腸埃希菌對喹諾酮類藥物的耐藥性不斷上升,同時,質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥基因在禽源大腸埃希菌中呈不斷上升的流行趨勢。

禽;大腸埃希菌;喹諾酮耐藥性;質粒介導

長期以來,以治療、預防疾病和促進畜禽生長為目的,不合理使用抗生素,導致抗生素過度使用或濫用,在抗生素的選擇性壓力下,大腸埃希菌耐藥性不斷上升,這已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。喹諾酮類藥物在臨床上是我國治療禽大腸埃希菌病的常規(guī)用藥之一,而對喹諾酮類藥物的不合理使用導致了細菌耐藥性的增加以及耐藥譜的變化,細菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制過去普遍認為主要為染色體基因突變,而不存在水平傳播的可轉移基因。近年來開始出現(xiàn)一些新的喹諾酮類藥物耐藥基因位于細菌質粒上,使得喹諾酮類藥物耐藥性在人獸共患病原菌間的迅速擴散成為可能,嚴重威脅人類健康。

1998年,Martinez-M artinez L等[2]發(fā)現(xiàn)了第一個質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥基因 qnr(現(xiàn)命名為qnrA),其編碼蛋白與Ⅱ型拓撲異構酶特異性結合,導致細菌耐藥。近年來,qnrB[3],qnrS[4],aac(6′)-Ib-cr[5],qepA[6]等新型質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥基因陸續(xù)被報道證實。質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥機制補充了傳統(tǒng)的細菌對喹諾酮類藥物的耐藥途徑,使得耐藥的形式多樣化。

本研究通過藥敏紙片法分析我國禽源大腸埃希菌對喹諾酮類藥物的耐藥性變化,同時通過PCR檢測質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥(PMQR)基因,了解PMQR在禽源大腸埃希菌中的流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源和培養(yǎng)條件 1993年-2009年從江蘇、上海等18個省、市、自治區(qū)收集具有大腸埃希菌病變的禽肝臟、脾臟、卵巢等作病料。大腸埃希菌病料直接劃線接種于麥康凱平板,37℃培養(yǎng)18 h,挑取典型菌落在麥康凱平板上分區(qū)劃線,37℃培養(yǎng)18 h后挑取單個典型菌落純培養(yǎng)后凍干保存,共分離并保存403株禽源大腸埃希菌。qnrA,qnrB,qnrS陽性菌株由浙江大學醫(yī)學院蔣琰博士惠贈;qepA陽性質粒由日本國家傳染病控制中心Yamane K教授惠贈;aac(6′)-ib-cr陽性菌株由本實驗室分離保存。質控菌:大腸埃希菌ATCC25922,金黃色葡萄球菌ATCC25923由本室保存。

1.1.2 主要試劑 8種抗生素藥敏紙片:萘啶酸(Nalicixic acid,NA),依諾沙星(Enoxacin,ENX),諾氟沙星(Norfloxacin,NOR),氧氟沙星(Ofloxacin,OFL),氟諾沙星(Fleroxacin,FLX),環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP),洛美沙星(Lomefloxacin,LM L),加替沙星(Gatifloxacin,GAT),均購自杭州微生物試劑有限公司;麥康凱干粉培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂(MH)等試劑為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品;DNA marker,DNA polym erase,FokⅠ購自寶生物工程(大連)有限公司;dNTP購自Promega公司;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.2 藥敏紙片試驗

按CLSI推薦的Kirby-Bauer法進行[7],對1993年-2008年分離的344株大腸埃希菌進行藥敏試驗,參照CLSI手冊中藥物敏感性標準作出結果判斷。

1.3 質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥(PMQR)基因的檢測

1.3.1 PMQR基因引物設計 根據(jù)文獻及Gen-Bank中已發(fā)表的序列,分別設計出針對 qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib 和 qepA 的 5對特異性引物(引物序列見表1),對403株大腸埃希菌分離株進行檢測。

表1 PCR引物序列Tab le 1 The sequences of prim ers for PCR

1.3.2 PCR擴增 細菌DNA模板的制備按全菌裂解法進行[10],qnr的PCR反應參數(shù)為94℃預變性3m in,94℃變性30 S,57℃退火30 S,72℃延伸40 S,共進行30個循環(huán);最后72℃延伸7 min,4℃保存,aac(6′)-ib和qepA的退火溫度為60℃。對于aac(6′)-ib基因陽性的菌株,PCR產(chǎn)物回收后通過FokⅠ酶切鑒定,變異體不存在此酶切位點,而野生型能被酶切。所有陽性菌株PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術有限公司測序。

2 結果

2.1 禽源大腸埃希菌藥敏紙片試驗結果

在8種喹諾酮類藥物中,大腸埃希菌對第一代喹諾酮類藥物萘啶酸的耐藥率最高(76.5%),對第四代喹諾酮類藥物耐藥率最低(19.8%)。耐藥率低于50%的有諾氟沙星(40.4%)、氧氟沙星(38.7%)、環(huán)丙沙星(44.8%)(表 2)。1993 年-1996年大腸埃希菌分離株耐藥率超過60%的僅有萘啶酸(61.6%),對其余7種藥物耐藥率均低于50%,其中有三種藥物的耐藥率低于20%,分別為諾氟沙星(19.2%)、氧氟沙星(18.1%)、加替沙星(10.7%)。1997年-2000年大腸埃希菌分離株對氟諾沙星(63.3%)和洛美沙星(60.0%)2種抗生素的耐藥率超過60%;2001年-2004年大腸埃希菌分離株對除加替沙星外的7種抗生素耐藥均超過66.7%,對萘啶酸的耐藥率達到97.7%。2005年-2008年間的大腸埃希菌雖然對前三代喹諾酮的耐藥率相較2001年-2004年稍有下降,但是仍然保持一個很高的耐藥率(表2)。

表2 禽源大腸埃希菌藥敏紙片試驗結果Table 2 The result of antimicrobial sensitivity test of avian E.coli isolatesby usingthe Kirby-Bauer method

2.2 質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測結果

在403株禽源大腸埃希菌中共檢測到qnrB陽性菌株3株,qnrS陽性菌株2株,aac(6′)-ib-cr陽性菌株5株,qepA陽性菌株5株,分別占菌株總數(shù)的0.7%,0.5%,1.5%,1.5%。陽性對照株擴增產(chǎn)物電泳結果見圖1,PMQR基因陽性菌株背景材料見表3。

圖1 陽性對照株PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of PCR products of positive strains

表3 質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥基因陽性菌株的背景資料Table 3 Characteristics of plasm id-mediated quinolone resistance strains

2.3 DNA測序結果

根據(jù)National Center for Biotechnology In formation(NCBI)中的BLASTn檢索結果顯示,陽性菌株所攜帶的喹諾酮類質粒耐藥基因序列與網(wǎng)上公布的序列一致。

3 討論

近年來,隨著喹諾酮類藥物的大量使用甚至濫用,大腸埃希菌對喹諾酮類藥物耐藥率不斷上升。本研究結果顯示,從上世紀90年代起禽源大腸埃希菌對喹諾酮類部分抗生素耐藥性已經(jīng)較強,近十幾年來大腸埃希菌分離株對大部分氟喹諾酮類抗生素耐藥性提高了兩倍以上。值得注意的是2005年-2008年分離株相較2001年-2004年雖然對1到3代喹諾酮類藥物的耐藥性稍有下降,但仍然維持了一個很高的水平,這種變化可能在一定程度上歸因于新藥的推廣以及近幾年對這些一到三代喹諾酮類藥物使用的逐漸減少,但是由于藥物之間的交叉耐藥性以及新出現(xiàn)的質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥基因在細菌之間的水平傳播,細菌的耐藥率仍然維持在很高的水平上;而大腸埃希菌分離株對加替沙星這種2002年在中國新上市的第四代氟喹諾酮類藥物的耐藥率則一直呈現(xiàn)明顯的上升趨勢,由之前的10.7%上升到36.0%。

近年來,對細菌喹諾酮類藥物的耐藥機理研究有了新的發(fā)現(xiàn),過去認為喹諾酮類藥物的耐藥性是由細菌染色體變異引起的,但新近研究表明質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥性也是其耐藥機制的重要組成部分。

質粒介導的喹諾酮耐藥(PMQR)于1987年孟加拉國一場Ⅰ型痢疾志賀氏菌爆發(fā)中首次發(fā)現(xiàn)[12],與PMQR相關的基因命名為qnr[13]。本研究對1993年至2009年間分離的403株大腸埃希菌進行檢測,共檢測到3株qnrB陽性菌株,2株qnrS陽性菌株;aac(6′)-ib-cr是氨基糖苷乙酰轉移酶的變異基因,其本質上是一種氨基糖甙類乙酰轉移酶基因aac(6′)-ib的變異體,故只能乙酰化含游離氨基的喹諾酮類,本研究中通過PCR和酶切鑒定共檢測到5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr基因陽性菌株,其中 4株細菌分離于2008年,1株分離于2009年;耐藥基因qepA通過調控外排泵相關基因從而引起細菌對喹諾酮類藥物耐藥水平的變化,本研究中共檢測到qepA陽性細菌5株,陽性率為1.2%,這其中4株陽性菌株來自同一大型養(yǎng)殖場,除1株對加替沙星中敏外,5株細菌對八種喹諾酮類藥物都表現(xiàn)出高度耐藥。

值得注意的是,2008年共檢測大腸埃希菌46株,其中1株細菌為qn rB陽性,4株aac(6′)-ib-cr陽性,PMQR基因的檢出率為10.9%;而在2009年,共檢測細菌31株,其中2株為qnrB、2株qnrS和1株aac(6′)-ib-cr陽性細菌,PMQR基因的檢出率為16.1%。近幾年來,PMQR基因在禽源大腸埃希菌中有不斷上升的流行趨勢。

以上結果顯示,近20年來,我國禽源大腸埃希菌對喹諾酮類藥物的耐藥性不斷增強,已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。雖然qnr、qepA和 aac(6′)-ib-cr僅介導低水平的喹諾酮類藥物耐藥性,但它們的存在有助于選擇出高水平的喹諾酮類藥物耐藥性[14]。一般認為低水平耐藥性可使細菌數(shù)量達到出現(xiàn)突變所需的濃度,從而出現(xiàn)高度耐藥。質粒介導的喹諾酮耐藥基因,不僅可垂直傳給子代,更重要的是可在不同微生物間進行水平傳播,加快喹諾酮類藥物耐藥性在細菌間的傳播。因此非常有必要在我國開展質粒介導喹諾酮類藥物耐藥性的調查研究和耐藥機制研究,監(jiān)測PMQR基因的流行情況,合理使用抗生素,以期減少喹諾酮類藥物耐藥菌的產(chǎn)生、人獸共患病原菌間耐藥性的傳遞并為藥物的開發(fā)和臨床合理使用提供理論依據(jù)。

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Detection of Plasm id-mediated Quinolone Resistance amongEscherchia colifrom Avian in China

ZHANGWe-iqiu,PAN We-i juan,CHEN Xiang,JIAO Xin-an

(Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

A totalof 403E.colifield isolates were derived from clinically affected chickens in 18 provincesof China between 1993 and 2009.Of which 344E.coliisolates from 1990s were carried out to 8 quinoloneant-i m icrobial sensitivity test by using the K irby-Bauer method recomm ended by CLSI(clinical and laboratory standards institute).A ll of the isolates were detected for the presence of qnrA,qnrB,qnrS,aac(6′)-ib-cr and qepA by PCR and sequencing.E.coliisolates from 1993-1996 had a resistancemore than 60%only to Nalicixic acid(61.6%),w hereas isolates from 2001-2008 had a resistancem ore than 58%to 7 antibiotics.Among the403E.coliisolates from China,qnrB,qnrS,aac(6′)-ib-cr and qepA were detected in 3(0.7%),2(0.5%),5(1.2%),and 5(1.2%)isolates,respectively,no qnrA positive isolatew as detected in this study.The results showed that the resistance ofE.colito quinolone agents had been increasing in the past twenty years and therewas a rising prevalence ofE.coliisolates harboring plasm id-mediated quinolone resistance genes in China.

avian;Escherchia coli;quinolone resistance;p lasm id m ediation

S854.43

A

1007-5038(2010)04-0074-05

2010-03-24

江蘇省自然科學基金(BK2008011);江蘇省高校自然科學研究項目(09KJB230002);江蘇省重點實驗室開放課題(K07016)

張維秋(1986-),女,山東臨沂人,碩士研究生,主要從事細菌耐藥方面的研究。*通訊作者

經(jīng)驗交流