袁 文,柴同杰,周玉法,苗增民,張紅雙,秦 梅

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技與動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東泰安 271018;2.泰安市岱岳區(qū)畜牧局,山東泰安 271000)

豬圈及其周邊社區(qū)環(huán)境大腸埃希菌氣溶膠產(chǎn)生及其傳播*

袁 文1,柴同杰*,周玉法2,苗增民1,張紅雙1,秦 梅1

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技與動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東泰安 271018;2.泰安市岱岳區(qū)畜牧局,山東泰安 271000)

目的是以大腸埃希菌為指示菌研究豬舍環(huán)境中微生物氣溶膠產(chǎn)生及向其舍外環(huán)境的傳播。采用Andersen-6級(jí)空氣微生物樣品收集器和RCS-離心式采樣器分別在4個(gè)豬場(chǎng)舍內(nèi)、舍外不同距離收集大腸埃希菌氣溶膠,計(jì)算每個(gè)采樣點(diǎn)大腸埃希菌的濃度;同時(shí),采集豬的糞便,分離大腸埃希菌。利用ERICPCR技術(shù),擴(kuò)增其DNA條帶,形成聚類圖譜。通過每一個(gè)采樣點(diǎn)大腸埃希菌遺傳相似性分析及其濃度變化的比較,確認(rèn)動(dòng)物舍微生物氣溶膠向舍外環(huán)境的傳播模式。結(jié)果表明,4個(gè)豬場(chǎng)舍內(nèi)空氣中大腸埃希菌的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于舍外大腸埃希菌濃度(P＜0.05)。52.4%糞便大腸埃希菌與舍內(nèi)空氣中的大腸埃希菌相似性可達(dá)90%以上;從豬場(chǎng)舍外下風(fēng)方向分離到的多數(shù)大腸埃希菌(55%)與舍內(nèi)空氣或糞便中分離的大腸埃希菌相似性可達(dá)90%以上。說明源于豬舍的微生物氣溶膠能夠傳播到舍外環(huán)境或居民社區(qū),具有流行病學(xué)及公共衛(wèi)生意義。

豬舍環(huán)境,大腸埃希菌氣溶膠,ERIC-PCR,遺傳相似性,流行病學(xué)及公共衛(wèi)生意義。

動(dòng)物舍環(huán)境中的微生物及其代謝產(chǎn)物形成的氣溶膠不僅能夠?qū)е颅h(huán)境污染,影響動(dòng)物的健康及生產(chǎn)能力[1],而且還能導(dǎo)致氣源性傳染病的流行。很多包括細(xì)菌和病毒在內(nèi)的氣載病原微生物都能夠通過空氣傳播很遠(yuǎn)的距離,造成傳染病的流行[2]。大量的事實(shí)表明[3-4],高致病性病原微生物以氣溶膠的形式傳染,提醒人們警惕氣源性傳染病。

為證明動(dòng)物舍微生物氣溶膠的來源及其向周圍環(huán)境的擴(kuò)散,過去曾經(jīng)通過動(dòng)物舍氣溶膠濃度的變化[5]、在設(shè)計(jì)其周邊環(huán)境中分離的細(xì)菌不同耐藥性[6]等證明微生物氣溶膠的發(fā)生與傳播的。但是,用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法很難區(qū)分遺傳關(guān)系極為相近的菌株,其鑒別能力是有限的。為此,本試驗(yàn)測(cè)量了4個(gè)豬場(chǎng)舍內(nèi)及舍外不同距離的大腸埃希菌含量,在細(xì)菌學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上,采用ERIC-PCR方法對(duì)不同地點(diǎn)分離的大腸埃希菌鑒定其同源性[7],獲得大腸埃希菌ERIC片段指紋圖譜,通過該片段在細(xì)菌基因組內(nèi)的數(shù)量和分布之間的關(guān)系分析,比較其遺傳相似性,獲得其遺傳距離,確認(rèn)了其發(fā)生及其傳播。

1 材料與方法

1.1 豬場(chǎng)情況

調(diào)查是從2008年3月到2009年2月在山東省棗莊市某豬場(chǎng)進(jìn)行,采樣豬舍(40 m×10 m×3.5m)均是機(jī)械通風(fēng)的封閉舍,存欄育肥豬120頭,每天進(jìn)行1次糞便清理。采樣時(shí)記錄下當(dāng)時(shí)的氣象指標(biāo)(表 1)。

表1 被調(diào)查的4個(gè)豬舍氣象指標(biāo)Tab le 1 Themeteorological index of four pig houses investigated

1.2 樣本的采集與處理

1.2.1 空氣樣品的采集 舍內(nèi)采用Andersen-6級(jí)撞擊式微生物樣品收集器,氣流速度28.3 L/min,收集器設(shè)置于豬舍中央,高度為70 cm,根據(jù)不同衛(wèi)生條件驅(qū)動(dòng)時(shí)間在1 m in～5m in之間;舍外(上風(fēng)向10、50m 和下風(fēng)向 10、50、100、200、400m)同時(shí)采用2臺(tái) RCS-離心式采樣器,采樣高度距離地面約1.5m,氣流速度為40 L/m in,根據(jù)距離的遠(yuǎn)近等因素收集時(shí)間在0.5 min～8 min之間,每個(gè)采樣點(diǎn)收集7個(gè)樣品,麥康凱培養(yǎng)基為采樣介質(zhì)。

1.2.2 空氣樣品的處理 將樣品置于恒溫箱37℃培養(yǎng)18 h～24 h后,把培養(yǎng)基上的所有菌落經(jīng)過“KOH反應(yīng)”試驗(yàn)鑒定其是革蘭陰性菌還是革蘭陽性菌。革蘭陰性菌再在麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行一次純分離培養(yǎng),然后用API 20E鑒定。統(tǒng)計(jì)采樣點(diǎn)大腸埃希菌的濃度(cfu/m3),并保存大腸埃希菌菌種。

1.2.3 糞便中大腸埃希菌的分離與鑒定保存 無菌收集新鮮的糞便樣品(10份/舍),置于冰盒內(nèi)冷藏運(yùn)輸,24 h內(nèi)分離大腸埃希菌,并按照1.2.2方法鑒定保存。

1.3 模板的制備

用煮沸法制備大腸埃希菌模板,并在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ERIC-PCR

ERIC引物[8]由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。ERIC-PCR反應(yīng)體系 25μL:10×buffer 2.5μL,0.2 mmol dNTPs,0.5UTaqDNA聚合酶,0.2 mmo lM gCl2,400 pmo l/L ERIC引物,3μL模板DNA,最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至25μL。反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性7m in;94℃變性1m in,52℃退火1 min,68℃延伸 8 m in,共30個(gè)循環(huán);最后65℃延伸10 m in結(jié)束反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L～15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離(1×TAE為電泳緩沖液,EB染色,3 V/cm條件下電泳1～1.5 h),電泳結(jié)果在紫外分析儀(Tanon-2500,Shanhai,China)上照相。

1.5 ERIC-PCR結(jié)果分析

計(jì)算機(jī)軟件記錄下擴(kuò)增及電泳普帶。利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建聚類樹狀圖。把每個(gè)分離株看作是一個(gè)分類學(xué)單位(OTU),并把相似性大于或等于90%的菌株看作起源相同的分離株[9]。

同一個(gè)豬舍內(nèi)外環(huán)境和糞便中的大腸埃希菌均采用一個(gè)反應(yīng)條件并同時(shí)一次完成,所有產(chǎn)物均使用同一塊凝膠進(jìn)行電泳,以便減少誤差。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

測(cè)得的大腸埃希菌濃度采用中間值表示,同時(shí)用最大值與最小值反映樣品間數(shù)值的波動(dòng)范圍。所獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2003和Spss 11.5進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 舍內(nèi)外不同距離空氣中大腸埃希菌含量

4個(gè)豬場(chǎng)舍內(nèi)測(cè)得的氣載大腸埃希菌濃度分別為:35、23、27和 21 cfu/m3。4個(gè)豬舍外上風(fēng)向 10、50m大腸埃希菌濃度分別為 A:4、2 cfu/m3;B:2、1 cfu/m3;C:3、2 cfu/m3;D:1、1 cfu/m3。下風(fēng)向10m處大腸埃希菌濃度分別為18、18、14、9 cfu/m3;下風(fēng)向50m 分別為7、3、8、4 cfu/m3;下風(fēng)向100m 分別為3、2、1、2 cfu/m3;下風(fēng)向 200m 分別為 1、2、1、1 cfu/m3;下風(fēng)向400 m沒有分離到。

A、B、C、D豬場(chǎng)舍內(nèi)與舍外不同距離(上風(fēng)向10、50 m 和下風(fēng)向 10、50、100、200、400 m)大腸埃希菌濃度差異顯著(P＜0.05);A、D豬場(chǎng)舍內(nèi)與舍外上風(fēng)向10、50m大腸埃希菌濃度差異顯著(P＜0.05),但是A、B豬場(chǎng)舍外不同距離間(10～200 m)的大腸埃希菌濃度差異不顯著(P＞0.05);下風(fēng)向10、50 m處與上風(fēng)向10、50 m處濃度差異顯著(P＜ 0.05)(表 2)。

2.2 ERIC-PCR結(jié)果

用ERIC-PCR方法對(duì)分離的大腸埃希菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到了每一個(gè)豬場(chǎng)舍內(nèi)外不同環(huán)境中大腸埃希菌的遺傳進(jìn)化樹狀圖(圖1-4)。具有相同遺傳進(jìn)化關(guān)系的大腸埃希菌具有相同的ERICPCR指紋圖譜[10]。

3 討論

通過比較豬舍內(nèi)外的氣載大腸埃希菌的含量發(fā)現(xiàn)(表2),A、B、C和D舍內(nèi)環(huán)境大腸埃希菌氣溶膠濃度高于舍外上風(fēng)方向到50m處(P＜0.05),也高于舍外下風(fēng)方向不同距離其濃度(P＜0.05)。但是,豬場(chǎng)A和D舍內(nèi)氣載大腸埃希菌濃度與下風(fēng)50m以內(nèi)大腸埃希菌的濃度差異并不顯著(P＞0.05)。顯示了舍內(nèi)微生物氣溶膠借助舍內(nèi)外氣體交換,隨著氣流傳播到舍外一定距離,50 m內(nèi)受其影響較重。另外,比較4個(gè)豬舍外下風(fēng)方向在50、100和200m之間大腸埃希菌的濃度差異不顯著(P＞0.05),表明氣載大腸埃希菌在一定的氣象條件下可以傳播到舍外下風(fēng)較遠(yuǎn)的距離(≥200m)。在所有檢測(cè)的豬舍下風(fēng)400m處都沒有檢測(cè)到大腸埃希

菌,原因可能是受到風(fēng)力因素的影響,大腸埃希菌含量較低;或者由于紫外線、氧氣含量、各種各樣的污染物以及溫度、相對(duì)濕度等因素影響微生物在空氣中的存活;或因較長(zhǎng)時(shí)間的采樣,應(yīng)激因素對(duì)細(xì)菌的傷害導(dǎo)致部分細(xì)菌死亡,難以培養(yǎng)生長(zhǎng)。

表2 4個(gè)豬場(chǎng)舍及其不同距離氣載大腸埃希菌的濃度(cfu/m空氣)(n=7)Table 2 The con cen tration of E.coli at different distan ce of the four pig houses(n=7)

圖1 豬舍A中,從不同采樣點(diǎn)分離的大腸桿菌遺傳關(guān)系聚類樹狀圖Fig.1 The genetic relationship dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm A

圖2 豬舍B中,從不同采樣點(diǎn)分離的大腸埃希菌 遺傳關(guān)系聚類樹狀圖 Fig.2 The genetic relationsh ip dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm B

圖3 豬舍C中,從不同采樣點(diǎn)分離的大腸桿菌遺傳關(guān)系聚類樹狀圖Fig.3 The genetic relationship dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm C

圖4 豬舍D中,從不同采樣點(diǎn)分離的大腸埃希菌 遺傳關(guān)系聚類樹狀圖 Fig.4 The genetic relationsh ip dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm D

ERIC-PCR技術(shù)是利用ERIC核心的高度保守反向重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR,作為一種準(zhǔn)確可靠的分子鑒定技術(shù),用于細(xì)菌病原學(xué)和分子流行性病學(xué)研究[9]。本試驗(yàn)中,ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖象經(jīng)過軟件分析自動(dòng)生成了矩陣圖,并利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建了聚類樹狀圖,經(jīng)過分析,獲得不同菌株之間的相似性。這種方法能夠有效地鑒定從同一豬舍不同采樣點(diǎn)采集到的大腸埃希菌之間的遺傳距離及其相似性。ERIC-PCR結(jié)果表明(圖1-4),52.4%糞便大腸埃希菌(4個(gè)豬舍分別為:2/4,50%;2/4,50%;3/6,50%;4/7,57.1%)與舍內(nèi)空氣中的大腸埃希菌相似性可達(dá)90%以上,表明舍內(nèi)空氣中的這些大腸埃希菌是由糞便中的同一菌株繁殖而來,來源相同。也就是說,糞便中的大腸埃希菌可以形成氣溶膠,污染舍內(nèi)空氣。

從豬場(chǎng)舍外下風(fēng)方向10、50、100、200 m 分離到的多數(shù)大腸埃希菌(55%,23/42)與舍內(nèi)空氣或糞便中分離的大腸埃希菌相似性可達(dá)90%以上,如豬舍A中Downw ind10m-2與Feces-2;Downw ind50m-1與Feces-1、Indoor-4的相似性為100%等。表明糞便中或舍內(nèi)空氣中的大腸埃希菌可以通過舍內(nèi)外氣體交換傳播到舍外。

而從豬舍上風(fēng)分離到的大腸埃希菌與舍內(nèi)空氣或糞便中的大腸埃希菌相似性較小,在66%～89%之間。表明從上風(fēng)方向分離到的這些大腸埃希菌與舍內(nèi)動(dòng)物糞便或舍內(nèi)空氣中的遺傳距離差別較大,有其它來源。

通過以上結(jié)果看出,ERIC-PCR對(duì)細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。在所測(cè)量的4個(gè)豬場(chǎng)舍內(nèi),豬的糞便中的大腸埃希菌能夠經(jīng)過一定的理化過程形成氣溶膠,進(jìn)入氣懸狀態(tài),對(duì)本豬群或飼養(yǎng)人員的健康形成威脅。而且,他們能夠隨著舍內(nèi)外氣體的交換傳播到周圍環(huán)境或社區(qū),對(duì)牧場(chǎng)周邊環(huán)境造成生物污染,或造成病原體的擴(kuò)散,致使傳染病的流行。以大腸埃希菌作為一種指示菌來研究動(dòng)物舍中微生物氣溶膠向周圍環(huán)境的傳播,具有獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)和流行病學(xué)意義。

致謝:本研究獲得中國國際合作項(xiàng)目“動(dòng)物疫源性人畜共患病病原體氣溶膠的監(jiān)測(cè)”[2009DFA32890]。

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ERIC-PCR Identification of the Formation and Sp reading ofEscherichia coliAerosols in Pig Houses

YUANWen1,CHAI Tong-jie*1,ZHOU Yu-fa2,M IAO Zeng-m in1,ZHANG Hong-shuang1,Q IN M ei1

(1.College of Animal Science,Shandong Ag ricultural University,Tai’an,Shandong,271018,Ch ina;2.Farm ing Bureau of Daiyue District in Taian City,Tai’an,Shandong,271000,China)

In order to have a full understanding of the form ation ofm icrobial aerosols in pig houses and of their spreading to surroundings,w ithEscherichia coli(E.coli)as the indicator bacterium.we collected theE.coliaerosols from 4 pig housesand their surroundings at different points,and calculated the concentration ofE.coliat each sam pling point.A t the sam e time,we collected the feces of pigs to separateE.coli.By the app lication of ERIC-PCR technology,we aimed to estab lish a cluster spectrum by w idening the DNA band ofE.coliisolates collected from different sam pling points.By analyzing the genetic sim ilarity ofE.coliiso lates and comparing the concentration change ofE.coli,weattem pted tom ake clear how m icrob-i al aerosols are formed in pig houses and spread to thesurroundings.The results showed that concentrations of airborneE.coliin the 4 pig houses were much higher than thosemeasured outdoor(P＜0.05).The ERIC-PCR resu lts also showed that52.4%of the fecalE.coliw ere identical to the indoor airborneE.coli-i solates,and there was more than 90%similarity between the majority ofE.coli(55%)isolated from downw ind air and those from indoor air or feces.The aerosols formed in a pig house can spread to the surroundings and to residential areas,and thus this study is of epidem io logical and pub lic health significance.

pig house;airborneEscherichia coli;ERIC-PCR;sim ilarity;epidem iological and public health significance

S851.24

A

1007-5038(2010)04-0027-05

2010-03-24

袁 文(1982-),女,山東濟(jì)南人,研究方向?yàn)閯?dòng)物微生物學(xué)。*通訊作者