張俊琪,瞿滌

1. 復旦大學上海醫(yī)學院病原生物系,上海 200032; 2. 復旦大學上海醫(yī)學院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室,上海 200032

腸桿菌科絲氨酸蛋白酶自動轉運家族(serine protease auto-transporters ofEnterobacteriaceae,SPATEs)蛋白僅存在于致病性腸道桿菌中,通過自動轉運的方式(又稱細菌的Ⅴ型分泌系統(tǒng))分泌到菌體外。大部分SPATE蛋白都是細菌分泌的重要毒力因子[1,2]。1994年,Provence和Curtiss[3]首次在禽致病性大腸埃希菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)上發(fā)現了第1個SPATE蛋白:溫度敏感血凝素(temperature-sensitive hemagglutinin,Tsh)。迄今已有超過20種的SPATE蛋白在大腸埃希菌、志賀菌、檸檬酸桿菌和沙門菌等致病性腸道桿菌中陸續(xù)發(fā)現(表1)。

表1常見致病性腸道桿菌產生的腸桿菌科絲氨酸蛋白酶自動轉運家族

Tab.1CommonSPATEsproducedbypathogenicenterobacteria

OrganismDiseaseProteinFunctionE. coli EHEC Blood diarrhea,hemorrhagic colitisEpeAEspP(α,β,γ,δ)UnknownProteolytic toxin, cytotoxinEPECDiarrheaEspCEnterotoxin, proteolytic toxinEAECDiarrheaPetEnterotoxinPicHemagglutinin, mucinase, cytotoxin?STECDiarrhea, renal failureEspIUnknownPssACytotoxin, proteaseUPECUrinary tract infectionPicUProteaseSatProteolytic toxin, vacuolating cytotoxinTsh_UPECUnkownETECDiarrheaAidA-B7AUnknownEatAUnknownHuman septic E. coli Wound infections,septicemiaHbp Heme-sequestering protein E. coli?EaaAUnknownEaaCUnknownAPECColibacillosis, septicemiaTsh_APECHemagglutinin, adhesin for RBCs, Hb, ECMVat APECVacuolating cytotoxinShigella flexneriShigellosisSepAProtease, inflammation, invasionSigAProteolytic toxin, cytotoxinPicHemagglutinin, mucinase,cytopathic effects on intestinal cells?IcsAMediator of intracellular motilitySalmonella bongoriDiarrheaBoaUnkown

SPATE蛋白的結構特點：①N端為可剪切的信號肽序列(N-terminal signal sequence);②中部為載乘結構域(passenger domain),是該蛋白家族發(fā)揮各種生物學功能的主要結構域;③C端為轉運單位(translocator unit)。

C端轉運單位的結構特點是在空間上由數個β折疊形成一個桶狀結構,插入革蘭陰性菌外膜的磷脂雙分子層,協(xié)助與之相連的載乘結構域自菌體周漿間隙向胞外分泌,從而剪切、加工為成熟的毒性蛋白。SPATE蛋白的載乘結構域具有絲氨酸蛋白酶共有的催化結構域GDSGS,因此這類蛋白均具有蛋白水解活性。研究發(fā)現,在腸道桿菌中只有致病菌才產生SPATE蛋白,而SPATE蛋白是這些細菌培養(yǎng)上清液中含量最高的蛋白,與細菌的毒力密切相關。

隨著結構化學和生物化學的發(fā)展,人們對SPATE蛋白的了解也越來越深,同時關于這類蛋白的一些新問題也在不斷出現。本文就SPATE蛋白的空間結構、轉運分泌過程、不同SPATE蛋白之間的結構差異以及生物學功能進行綜述,并對今后SPATE蛋白的研究方向進行討論和展望。

1 N端信號肽序列與SPATE前體蛋白原的跨內膜轉運

SPATE蛋白在菌體胞質中首先以N端帶有一段信號肽序列的前體蛋白原(pre-pro-protein)的形式出現,而后通過secretion(sec)系統(tǒng)的轉運跨過細胞膜，進入周漿間隙。生物信息學研究表明,SPATE信號肽一級結構具有sec依賴的信號肽特點,在功能上自N端起可劃分為3個區(qū)域:正電荷氨基酸殘基組成區(qū)、含疏水核心基團區(qū)〔與信號識別顆粒(signal recognition particle,SRP)或分泌蛋白B(secretion protein B,SecB)的結合部位,一級結構相對保守〕及具有信號肽酶識別位點的保守區(qū)[4],結構見圖1。

圖1腸桿菌科絲氨酸蛋白酶自動轉運家族結構示意圖

Fig.1StructureofSPATE

SPATE信號肽由48～59個氨基酸殘基組成,與只含18～26個氨基酸殘基的典型信號肽序列相比,這種加長的信號肽可能與轉運大分子蛋白有關〔SPATE蛋白的相對分子質量(Mr)均超過100×103〕。目前關于SPATE蛋白與sec系統(tǒng)的相互作用存在2種假說:SecB依賴學說和SecB非依賴學說。前者認為SPATE蛋白通過信號肽與分子伴侶SecB識別結合后,由SecB將前體蛋白原轉運至位于細菌內膜上的分泌蛋白YEG(secretion proteins Y,E and G,secYEG);后者認為這些不同尋常的長信號肽序列的識別需要一些不同于SecB的輔助蛋白,如SRP的參與,SecB在其中不起作用。SecB蛋白在轉運過程中的作用有待進一步闡明[5,6]。

此外,對腸出血性大腸埃希菌(enterohaemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)的分泌蛋白P(Escherichiacolisecretion protein P,EspP)和腸黏附性大腸埃希菌(enteroaggregativeEscherichiacoli,EAEC)的質粒編碼毒素(plasmid-encoded toxin,Pet)研究發(fā)現,加長的信號肽結構除了幫助SPATE前體蛋白原轉運至細菌內膜外,還可有效延緩SPATE蛋白通過細菌內膜的速度,從而避免已穿過內膜的前體蛋白在菌體周漿間隙發(fā)生錯誤折疊,影響后續(xù)的分泌過程[7,8]。

2 C端轉運單位與SPATE前體蛋白在外膜上的加工處理和轉運

當SPATE前體蛋白原穿過細菌內膜后,N端信號肽被切割,前體蛋白進入周漿間隙,載乘區(qū)域進行部分空間折疊。目前研究表明,至少有1個分子伴侶降解蛋白(degradation protein,DegP)在結構上與SPATE蛋白C端轉運結構域具有高度同源性[9-11],提示DegP參與協(xié)助前體蛋白從細菌周漿間隙穿越細菌外膜并分泌到體外的過程。

目前發(fā)現所有SPATE蛋白C端轉運單位均具有十分相似的一級結構和高級結構:由277個氨基酸殘基組成,在空間上折疊成1個β桶狀結構。因此認為,SPATE蛋白可通過自身轉運單位形成的β桶狀結構直接插入外膜的磷脂雙分子層,從而協(xié)助載乘區(qū)域的轉運。外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)YaeT/Omp85并沒有參與其中或者只是起到十分微弱的作用[11,12]。在SPATE蛋白的結構中,C端轉運單位在結構上保守性最高,各SPATE蛋白一級結構氨基酸組成和結構的同源性超過60%。

在連接載乘區(qū)域與C端轉運單位的數個β折疊之間有個α螺旋形成的鉸鏈區(qū),其中14個氨基酸殘基組成的序列EVNNLNKRMGDLRD非常保守,是蛋白酶水解位點,也是整個蛋白中最長的保守氨基酸序列。研究證實,這一切割位點由結構非常保守的2個連續(xù)天冬氨酸殘基組成,在空間上位于轉運部分，即β桶狀結構的內部(孔內)。當其殘基突變時,盡管不能阻斷轉運單位插入細菌外膜中,但可嚴重降低或阻止載乘區(qū)域向菌體細胞外分泌。由于鉸鏈區(qū)在裝配和維持β桶狀結構的穩(wěn)定性、保證載乘蛋白的正確折疊、協(xié)助載乘蛋白靶向定位到外膜以及從外膜向外分泌的過程中扮演著十分重要的角色,因此其改變往往會引起SPATE蛋白不能正常分泌和成熟。目前有研究人員正考慮將其作為抗菌藥物作用的新靶點。

當SPATE蛋白通過外膜到達菌體細胞表面,其C端轉運單位被切割,成熟的SPATE蛋白載乘區(qū)域分泌到菌體細胞外,從而發(fā)揮各自的生物學功能。

3 中部載乘區(qū)域中的保守結構變化決定著SPATE蛋白功能的多樣性

通過分泌、剪切和正確折疊后,成熟的SPATE蛋白載乘結構域(主要功能區(qū))具有活性。雖然SPATE蛋白在功能上千差萬別,但在載乘結構域的一級結構和空間構象上卻有很多相似之處。根據SPATE蛋白一級結構的特點,推測SPATE蛋白的二級結構易形成平行的β折疊,從而在空間上易形成β螺旋桶狀結構。該假設已經通過血紅蛋白蛋白酶(haemoglobin protease,Hbp)的晶體結構分析得以證實[13]。對Hbp結構分析表明,載乘區(qū)域主干結構由相同的24個右手β螺旋構成,每個螺旋由3個β片層結構組成，這些β片層結構被一個個回環(huán)結構分割。在一級結構的組成上,β片層結構中氨基酸組成和排列比回環(huán)結構更保守。除了β螺旋這樣保守的主干核心結構外,Hbp載乘區(qū)域的N端還可形成2個球狀功能域。區(qū)域1由載乘區(qū)的第1～256氨基酸殘基組成,折疊成胰島素樣蛋白酶,這與成熟載乘區(qū)域的蛋白水解活性密切相關;區(qū)域2由載乘區(qū)的第481～556殘基組成,結構上與幾丁質酶chitin蛋白的結合域很相似,推測與該蛋白的黏附功能有關。

對已知的SPATE蛋白進行生物信息學分析得出[6],在載乘區(qū)域1 200個左右的氨基酸殘基中,約有173個是保守的,它們在維持SPATE蛋白空間結構的穩(wěn)定性和功能的特殊性上可能發(fā)揮非常重要作用。這些保守的氨基酸殘基在三級結構上主要分布在以下2個區(qū)域:①在173個保守氨基酸殘基中,有122個是疏水性氨基酸,總是一個個重疊排列分布在β螺旋的主干結構中,在一定程度上說明非極化作用在維持主干β螺旋結構的穩(wěn)定性和分割主干與球狀功能域上很重要。②主干結構的頂端有1個與球狀功能域的分割面(interface),這一分割面在SPATE蛋白還鉚在細菌外膜層上時已經突出于細菌細胞表面,扮演底物識別位點的角色。這個界面也有5個保守模塊(conserved motif):第1個保守模塊是由H125、D153和G257DSGS組成的催化三聚體,三聚體中第1個絲氨酸殘基與蛋白水解作用有關[14,15];另外4個保守模塊在空間上與催化三聚體保持固定距離,影響絲氨酸蛋白酶活性。模塊DFS距離催化三聚體大約1.1 nm;模塊DxLHKxGxGxL和LKxGxGxVxL與模塊RLxKxVxE大約相距0.8 nm。這些保守模塊可能與蛋白的功能密切相關。

此外,SPATE蛋白載乘區(qū)域C端第950～1 048氨基酸殘基的組成也十分保守,這一保守模塊是載乘區(qū)域二級結構β折疊形成的核心催化域,控制著載乘區(qū)域折疊發(fā)生的頻率和穿越菌體外膜的速度。

除了在結構上具有高度相似性外,SPATE蛋白的載乘區(qū)域有各自嚴格的底物專一性。有人提出將SPATE蛋白分成兩類:一類具有細胞毒活性;另一類具有細胞外的特殊靶點,從而具備血凝素結合等特殊的生物活性。分析SPATE蛋白的氨基酸組成和排列,發(fā)現兩者的載乘區(qū)域結構不同:具有血凝素結合特性的SPATE蛋白含特殊的結構域2(domain 2);而具有細胞毒性的SPATE蛋白含特殊的結構域2A(domain 2A),協(xié)助SPATE蛋白與細胞表面的受體結合[16]。

4 SPATE蛋白之間的結構差異

目前一些新發(fā)現的SPATE蛋白與傳統(tǒng)的SPATE蛋白具有不同的特征，如新近發(fā)現的兔腸致病性大腸埃希菌SPATE蛋白在C端轉運單位的鉸鏈區(qū)不具備保守的剪切位點,這也是目前已知SPATE蛋白中唯一一個在C端沒有該位點的蛋白。

在SPATE蛋白中,結構域的差異決定不同的生物學功能。生物信息學數據揭示大約有6個這樣的變異區(qū)域。變化最大的區(qū)域主要存在于載乘區(qū)域右手β螺旋的回環(huán)結構中;另一個易變區(qū)域存在于載乘區(qū)域N端的一個球形域chin蛋白結合位點上,這一部分氨基酸會形成一個環(huán)-鏈-環(huán)的二級結構而從β螺旋主干中延伸出來，該結構在SPATE蛋白中非常普遍,其生物學功能目前尚不清楚；剩下4個變化較大的區(qū)域全部位于載乘區(qū)域β螺旋主干環(huán)內。環(huán)的位置和獨特性可能與蛋白的特殊功能密切相關，使得這一家族蛋白在功能上有著各自鮮明的特點。

5 展望

SPATE蛋白是存在于很多致病性腸道桿菌中的多功能毒性相關蛋白。雖然對其中一些蛋白的功能、結構和分泌機制的研究為洞察此類蛋白奠定了一定基礎,但SPATE家族蛋白中許多成員的功能和結構尚不明確,還有許多問題迄待研究,如延長的SPATE信號肽在降低蛋白從內膜向周漿間隙的轉運速度中發(fā)揮怎樣的作用？部分或全部折疊在周漿間隙中的SPATE多肽鏈與分子伴侶和DegP之間如何相互作用而促使載乘區(qū)域形成β桶狀結構？SPATE蛋白的自動剪切作用如何調節(jié)？這種剪切作用是否發(fā)生在SPATE蛋白與周漿間隙的相互作用中？當載乘區(qū)域從外膜上剪切并釋放后,C端轉運單位的結局如何？SPATE蛋白載乘區(qū)域中哪一段殘基部分與致病功能直接相關？從分子水平如何解釋這些功能的多樣性？

盡管大多數致病性腸道桿菌通常產生1種以上的SPATE蛋白[17],并且不斷有新的SPATE蛋白亞型被發(fā)現[18],但SPATE蛋白在結構和分泌機制上具有共性。對SPATE蛋白的進一步深入研究將有助于人們設計具有針對性的共同抑制劑,從而有效降低致病菌毒力,開發(fā)具有與以往抗生素結構和作用機制完全不同的抗菌制劑。

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