董丹丹，高謙

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032

結(jié)核病是一種古老的疾病，但到目前為止，由于缺乏有效的疫苗，該病仍然是全球公共衛(wèi)生的重大威脅，每年全球有超過200萬人死于結(jié)核病[1]。近年來,結(jié)核分枝桿菌與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)共感染發(fā)病率不斷上升。而多重耐藥結(jié)核(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)菌株尤其是廣泛耐藥結(jié)核(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)菌株的出現(xiàn)和傳播，為結(jié)核病的治療帶來了巨大困難。中國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[2]，2009年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)發(fā)布報告，2008年中國結(jié)核病發(fā)病100萬～160萬人，僅次于印度，居世界第2位。所以結(jié)核病的預(yù)防和控制在我國尤為重要。據(jù)估計，全球有1/3的人口已潛伏感染了結(jié)核分枝桿菌，但是只有5%～10%的感染者會發(fā)展為活動性肺結(jié)核病。發(fā)病原因尚不明確，可能與所感染菌株的毒力、菌量以及引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答密切相關(guān)。分子流行病學(xué)研究表明，一些特定基因型的菌株能在某些地區(qū)暴發(fā)流行。不僅細(xì)胞和動物實驗顯示這些菌株在毒力和引發(fā)宿主免疫應(yīng)答方面具有優(yōu)勢，臨床觀察的結(jié)果也表明不同基因型的菌株具有不同的臨床表型。因此研究結(jié)核分枝桿菌進(jìn)化與致病性之間的關(guān)系能夠為結(jié)核病的預(yù)防、控制和治療提供重要的參考。

1 古老結(jié)核分枝桿菌的種系發(fā)生及進(jìn)化

結(jié)核分枝桿菌是一種古老的細(xì)菌，與大多數(shù)細(xì)菌不同，其基因組序列極其保守，基因組的單核苷酸突變率僅為0.01%～0.03%[3]。而大腸埃希菌EDL933和MG1655的全基因組僅在基因組骨架上就有75 168個單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)，突變率達(dá)1.8%[4]。目前還沒有證據(jù)表明結(jié)核分枝桿菌具有基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[5]，而基因水平轉(zhuǎn)移通常是造成細(xì)菌基因組遺傳變異性的重要原因。然而，在長期進(jìn)化過程中，結(jié)核分枝桿菌也必然積累一些遺傳變異信息，如在基因組中存在與真核生物類似的重復(fù)單元區(qū)域，被認(rèn)為是其遺傳多樣性的表現(xiàn)。

最近，Gutierrez等對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的6個管家基因(katG、gyrB、gyrA、rpoB、hsp65和sodA)以及16S rRNA基因進(jìn)行測序，研究菌株進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與人類起源一樣，結(jié)核分枝桿菌的起源可追溯到300萬年前[6]的非洲大陸，古老的結(jié)核分枝桿菌曾在人類祖先中暴發(fā)流行，并伴隨著人類的遷徙，分布到全世界的不同區(qū)域。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)出一個新的觀點，即結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化與人類的進(jìn)化和遷徙密切相關(guān)。 在15 000～20 000年前，分枝桿菌經(jīng)歷了一個進(jìn)化瓶頸[7]，古代的不同結(jié)核分枝桿菌幾乎全部消失，僅其中一個分支保留下來，導(dǎo)致目前全球流行的菌株都是結(jié)核分枝桿菌的同一個分支，即所謂的現(xiàn)代菌株。長片段缺失分析發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代菌株基因組中具有TbD1的缺失。這種具有種群優(yōu)勢的結(jié)核分枝桿菌隨著人類的遷徙走出非洲，逐漸傳播到其他大陸，于是有了目前結(jié)核分枝桿菌各基因型在全球的不同分布[7]。

2 SNP是研究群體進(jìn)化結(jié)構(gòu)的有力工具

近年來，有很多研究致力于分析結(jié)核分枝桿菌的群體進(jìn)化結(jié)構(gòu)[5,6]，即運(yùn)用各種基因型分型方法繪制出一幅詳細(xì)的進(jìn)化樹，如間隔區(qū)寡核苷酸分型(spoligotyping)和長片段缺失分析[8]，特別是近年發(fā)展起來的SNP分型法分辨率更高，為研究菌株的進(jìn)化關(guān)系提供了有力的工具。結(jié)核基因組上的SNP位點(SNP loci)可以是同義突變，也可以是導(dǎo)致氨基酸改變的非同義突變，這2類突變?yōu)檠芯考?xì)菌進(jìn)化提供了極其有用的信息。一般來說，由于非同義突變引起氨基酸序列的改變，可能在內(nèi)在或外部環(huán)境的選擇壓力下帶來趨同進(jìn)化的結(jié)果。如結(jié)核分枝桿菌的耐藥往往與基因組上特定藥物靶標(biāo)的基因發(fā)生突變或缺失相關(guān)[9,10]，因此在耐藥基因關(guān)鍵位點上的非同義突變可能改變菌株的耐藥性。相反，同義突變不會帶來氨基酸序列的改變，這種突變被視為中性。當(dāng)同義突變發(fā)生在管家基因時，就成為研究菌株間遺傳和進(jìn)化關(guān)系的關(guān)鍵位點。所以SNP不僅能對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型，也是研究種系發(fā)生的有力工具。

為了利用同義突變研究結(jié)核分枝桿菌的種系發(fā)生和進(jìn)化，Sreevatsan 等首先運(yùn)用katG和gyrA上的2個非同義突變位點，將現(xiàn)代結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群劃分為3個大的遺傳群體(principle genetic group，PGG)：PGG1、PGG2和PGG3[11]。此后，Gutacker等應(yīng)用來源于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的230個同義突變分析不同地域來源的臨床菌株，將結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群分為8個家族：Ⅰ～Ⅷ。選出具有代表性的36個同義突變，對5 069個菌株進(jìn)行分型，得到相似的進(jìn)化結(jié)構(gòu)，即同樣的8個家族和1個新的家族ⅡA[12,13]。這9個家族與PGG之間有很好的對應(yīng)關(guān)系，即PGG1包括家族Ⅰ、Ⅱ、ⅡA，PGG2包括家族Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，PGG3包括家族Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ。目前全基因組已測序完成的菌株H37Rv、CDC1551分別屬于家族Ⅷ和Ⅴ，而在亞洲和北美地區(qū)流行的北京基因型菌株均屬于家族Ⅱ。從全球的菌株分布來看，PGGI主要在亞洲、美國和非洲的一些地區(qū)流行，PGG2主要在南、北美洲和加勒比海地區(qū)流行，而PGG3在全球各地均有分布。

利用SNP來研究種系發(fā)生和進(jìn)化，入選菌株的代表性及數(shù)量、SNP位點的代表性及數(shù)量決定了進(jìn)化樹的形狀和分支程度。實際上，有目的地選擇一些具代表性的同義突變位點能很好地揭示結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化關(guān)系。更重要的是，由于SNP有較高和穩(wěn)定的分辨率，人們能將基因型分型的結(jié)果聯(lián)系菌株的生物學(xué)表型，如菌株的致病力，從而有希望為結(jié)核病的預(yù)防﹑控制﹑治療和轉(zhuǎn)歸提供一定的指導(dǎo)。

3 從基因型到表型，從進(jìn)化到毒力差異

研究發(fā)現(xiàn)，不同的臨床菌株具有不同的致病性。目前在實驗室中已建立用動物模型和細(xì)胞模型來鑒定菌株毒力的方法。在小鼠和豚鼠模型中，不同毒力的菌株主要表現(xiàn)為宿主的不同免疫應(yīng)答及致死率，以及對藥物治療的不同敏感程度[14,15]。在巨噬細(xì)胞模型中，細(xì)菌的胞內(nèi)繁殖速度、吞噬溶酶體成熟與否、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞因子的釋放都是重要的檢測指標(biāo)。

分子流行病學(xué)研究證明，一些特異基因型的菌株能引起特異的生物學(xué)表型[16,17]，如Valway等報道曾經(jīng)引起暴發(fā)流行的菌株CDC1551具有很高的傳播力[18,19]。CDC1551一度被認(rèn)為具有很高的致病性，因為對其感染人群進(jìn)行皮膚測試時發(fā)現(xiàn)，純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)能引發(fā)很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，即大面積的皮膚紅腫[18]。在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv相比，CDC1551的毒力反而較弱。這一現(xiàn)象的合理解釋在于CDC1551能誘發(fā)更強(qiáng)的早期免疫應(yīng)答，如釋放大量腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-10和IL-12。這些炎癥因子的釋放一方面可使人在PPD皮膚測試時表現(xiàn)為大面積皮膚紅腫，另一方面在小鼠實驗中使小鼠免疫應(yīng)答加強(qiáng)，死亡率降低[20]。相反，有很多證據(jù)表明北京基因型菌株可能具有較高的毒力[21]。被北京基因型菌株(PGG1，cluster II)HN878感染的小鼠，因細(xì)胞因子釋放減少及肺部載菌量劇增而迅速死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HN878偏向于誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子釋放[20,22]。與HN878具有相同基因型及在多個地區(qū)造成流行暴發(fā)的菌株210也被證實具有很強(qiáng)的致病性，其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖速度是其他臨床菌株的4～8倍[23,24]。

目前有很多研究致力于尋找各個進(jìn)化分支上菌株的生物學(xué)表型差異[25,26]。如López等用動物模型比較全球流行的4種不同遺傳背景的菌株，發(fā)現(xiàn)北京基因型菌株毒力最強(qiáng)，且能在一定程度上抑制宿主的免疫反應(yīng)。檢測巨噬細(xì)胞受細(xì)菌感染后釋放的細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，不同遺傳背景的菌株誘導(dǎo)不同的細(xì)胞因子圖譜[27,28]。Dormans 等從荷蘭國立衛(wèi)生研究院收集的8 000株具有IS6110分析信息的菌株中，挑選19株分屬于11個基因型的菌株，分別感染小鼠，發(fā)現(xiàn)這些菌株的致病性及其引發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)都有顯著差異[19]，說明不同的臨床菌株在體外和體內(nèi)模型中表現(xiàn)出的致病性和誘發(fā)宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有顯著差異。因此，未來結(jié)核分枝桿菌基因型的信息對臨床治療可能有很大的指導(dǎo)意義。

已經(jīng)有一些臨床治療的數(shù)據(jù)支持這一觀點。Thwaites等分析397株臨床分離菌株及其引發(fā)的癥狀后發(fā)現(xiàn)，北京基因型菌株引起的結(jié)核性腦膜炎病程縮短，腦脊液中白細(xì)胞數(shù)量降低[29]，而歐美菌株感染與肺組織實變相關(guān)。這意味著不同的菌株基因型對疾病的進(jìn)程及宿主的免疫應(yīng)答有顯著影響。van Crevel等曾報道，感染北京基因型菌株的患者在治療初期出現(xiàn)短暫的體溫升高[30]。這一差異可能是由于北京基因型菌株能誘導(dǎo)不同的宿主免疫反應(yīng)；而在肝毒性和菌株耐藥性方面，感染北京基因型菌株的患者與感染其他菌株的患者沒有顯著差異。如果能夠?qū)⒕甑亩玖Σ町惻c臨床患者的癥狀，如病程發(fā)展速度與轉(zhuǎn)歸之間建立聯(lián)系，那么鑒定菌株的基因型別將在臨床治療中發(fā)揮更大作用。目前，美國國立衛(wèi)生院正在建立一個數(shù)據(jù)庫，內(nèi)容包括全美國臨床分離的結(jié)核分枝桿菌的基因型、菌株耐藥譜，以及患者的臨床癥狀和轉(zhuǎn)歸等信息，作為治療的參考數(shù)據(jù)，讓醫(yī)生能夠?qū)Σ煌暌l(fā)的結(jié)核病進(jìn)行針對性的用藥和治療。然而，僅目前的臨床數(shù)據(jù)以及在動物和細(xì)胞水平對數(shù)量有限的菌株所做的研究結(jié)果，很難對菌株的進(jìn)化與致病性的關(guān)系下結(jié)論，還有待進(jìn)一步研究以提供更多的實驗室和臨床數(shù)據(jù)。

4 結(jié)語

目前，結(jié)核分枝桿菌基因型分型手段日趨豐富，結(jié)核分枝桿菌種系遺傳關(guān)系逐漸被闡明，菌株基因型與生物學(xué)表型的關(guān)系越來越受到關(guān)注。運(yùn)用高分辨率的分型法可更好地將菌株不同的遺傳背景與其不同的毒力和致病力聯(lián)系起來，研究特有基因型菌株的致病性和傳播特征、高致病性菌株的種系發(fā)生和地理分布，對結(jié)核病的預(yù)防﹑控制及臨床治療有巨大意義。

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