沈洪波，王洪海

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)研究所遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的重大傳染病，嚴(yán)重危害人類健康。目前全球大約有1/3人口感染了結(jié)核分枝桿菌，其中5%～10%轉(zhuǎn)化成活動性結(jié)核病。近幾年來，結(jié)核病的發(fā)病率和病死率持續(xù)增加[1]。多重耐藥菌株的出現(xiàn)是近年來全球結(jié)核病疫情肆虐的主要原因之一[2-4]。針對多重耐藥結(jié)核病的治療非常困難，與治療敏感菌感染引起的結(jié)核病相比，失敗率要高80倍，且預(yù)示著多重耐藥結(jié)核病有成為不治之癥的危險[5]。目前直接監(jiān)督下的短期化療(directly observed treatment, short course，DOTS)方案治療周期過長，且現(xiàn)有抗結(jié)核藥物主要作用于生長活躍的結(jié)核分枝桿菌，不能有效殺死生長緩慢或處于休眠期的結(jié)核分枝桿菌，容易產(chǎn)生耐藥菌株。因此，如何有效殺死胞內(nèi)殘存的結(jié)核分枝桿菌，預(yù)防結(jié)核病復(fù)發(fā)，以及有效治療耐藥結(jié)核分枝桿菌感染，是結(jié)核病研究面臨的重大挑戰(zhàn)。

疫苗接種可有效激發(fā)宿主針對結(jié)核分枝桿菌的特異性免疫反應(yīng)，有助于清除宿主體內(nèi)殘存和休眠期的結(jié)核分枝桿菌。傳統(tǒng)的結(jié)核病疫苗主要用于疾病預(yù)防[6]。未來疫苗開發(fā)的目標(biāo)包括研制針對潛伏感染的疫苗，抑制、清除潛伏感染的細(xì)菌，阻止結(jié)核病復(fù)發(fā)[7]；同時，要開發(fā)接種于已感染結(jié)核分枝桿菌(尤其是耐藥結(jié)核分枝桿菌)個體的新型疫苗，配合化學(xué)抗結(jié)核藥物的使用，徹底清除耐藥的以及殘留的結(jié)核分枝桿菌。

接種于已感染個體的疫苗，稱為治療性疫苗，是近年建立和發(fā)展起來的免疫治療新概念[8]。1999年，Lowrie等在Nature報道了表達(dá)熱休克蛋白60(heat-shock protein 60，Hsp60)的DNA疫苗，用于小鼠結(jié)核病治療的研究[9]，進(jìn)一步激發(fā)了學(xué)者們對治療性結(jié)核病疫苗的研究興趣。目前，治療性結(jié)核病疫苗的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。治療性疫苗RUTI(無毒的結(jié)核分枝桿菌片段)已成功完成了臨床Ⅰ期試驗[10]。

1 治療性結(jié)核病疫苗的作用機(jī)制

結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染是結(jié)核病防治中的一大隱患。在潛伏感染者體內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌的復(fù)制變得非常緩慢或已經(jīng)休眠，即結(jié)核分枝桿菌已適應(yīng)了宿主的免疫環(huán)境，從快速生長狀態(tài)轉(zhuǎn)變到非復(fù)制的緩慢生長狀態(tài)，抗原表達(dá)譜較快速生長狀態(tài)時有顯著差異。在目前的結(jié)核病化學(xué)治療過程中，抗結(jié)核藥物殺死了快速生長的結(jié)核分枝桿菌，卻無法徹底清除生長緩慢的細(xì)菌，也造成部分細(xì)菌在宿主體內(nèi)殘留[11]。這些細(xì)菌生長緩慢或處于休眠狀態(tài)，數(shù)目極少，產(chǎn)生的抗原量少，導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)小，激起細(xì)胞免疫的能力有限，因此宿主免疫系統(tǒng)無法將其清除[12]。

宿主通過氣溶膠感染結(jié)核分枝桿菌后，獲得性免疫在肺部的誘導(dǎo)表達(dá)非常緩慢[13]。結(jié)核分枝桿菌存在于宿主肺部的肺泡組織(alveolar tissue)，生長緩慢，激起的肺泡組織免疫反應(yīng)非常微弱。結(jié)核分枝桿菌感染樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)后，降低DC激發(fā)T細(xì)胞的活性。感染的DC由肺移動到淋巴結(jié)大約需要14 d；T細(xì)胞激活后，DC轉(zhuǎn)移到感染部位大約在感染后的15～18 d[13]。這樣就給結(jié)核分枝桿菌提供了足夠時間，擴(kuò)增到一定數(shù)目，從而干涉宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效表達(dá)，建立穩(wěn)定的感染。獲得性免疫雖然能控制細(xì)菌生長，但在細(xì)菌數(shù)目多到一定程度后，細(xì)菌生長就無法控制[13]。因此，免疫反應(yīng)的慢啟動對于疾病控制非常不利。

治療性結(jié)核病疫苗的主要任務(wù)是誘導(dǎo)和增強(qiáng)以抗原為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，通過誘發(fā)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫應(yīng)答，殺死細(xì)胞內(nèi)寄生的結(jié)核分枝桿菌。研究表明，Th1型為主的細(xì)胞免疫對抗結(jié)核分枝桿菌感染具有重要作用。DNA疫苗等治療性疫苗能將低效的抑菌反應(yīng)轉(zhuǎn)換成高效的殺菌反應(yīng)，讓外源基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)出的抗原能在細(xì)胞質(zhì)中與主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子結(jié)合，然后被呈遞到細(xì)胞表面。CD8+T細(xì)胞在識別含有抗原肽的MHCⅠ類分子后，產(chǎn)生可裂解細(xì)胞的效應(yīng)分子。這些效應(yīng)分子具有穿膜活性，如perforin和granulysin，由此降解靶細(xì)胞[14]。這些效應(yīng)分子還能破壞宿主細(xì)胞內(nèi)存活的結(jié)核分枝桿菌。CD8+T細(xì)胞也能產(chǎn)生Th1型的典型細(xì)胞因子[15]，促進(jìn)調(diào)理作用抗體的產(chǎn)生。調(diào)理作用抗體有助于宿主細(xì)胞吞噬胞外結(jié)核分枝桿菌，從而阻斷病原體從干酪樣壞死部位向遠(yuǎn)距離組織擴(kuò)散。

在治療性疫苗中，卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)已無法發(fā)揮重要作用[13]。因為結(jié)核分枝桿菌感染阻止BCG的復(fù)制，BCG不能作為后感染疫苗提供保護(hù)。同樣道理，許多活的全菌疫苗也不能提供有效的免疫保護(hù)。但是，亞單位疫苗僅表達(dá)少數(shù)重要抗原基因，其表達(dá)不會像BCG一樣被阻止，并能激活重要抗原在感染個體中的免疫活性，誘導(dǎo)抗原特異性淋巴細(xì)胞發(fā)揮吞噬功能，且不會對宿主造成嚴(yán)重的免疫病理后果。

2 治療性結(jié)核病疫苗

治療性結(jié)核病疫苗的主要任務(wù)是激發(fā)宿主特異的保護(hù)性免疫反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)發(fā)生在疾病進(jìn)行中的非保護(hù)性免疫反應(yīng)，使其向保護(hù)性Th1型反應(yīng)發(fā)展，從而有助于清除潛伏的結(jié)核分枝桿菌，縮短傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療療程。為實現(xiàn)這一目的，目前的結(jié)核病疫苗的研究主要集中在以下幾個方面。

2.1 基于結(jié)核分枝桿菌抗原的疫苗

結(jié)核分枝桿菌為了適應(yīng)宿主體內(nèi)的免疫環(huán)境，使早期表達(dá)的蛋白成為宿主免疫系統(tǒng)的誘騙(decoy)蛋白，因此只有在潛伏感染期首次表達(dá)的蛋白才是治療性疫苗表達(dá)的重要抗原。目前，對誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌休眠的條件及細(xì)菌對這些條件的反應(yīng)還知之甚少。但有證據(jù)表明，控制細(xì)菌在動物模型中的復(fù)制需產(chǎn)生γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和一氧化氮。另外，模擬病原菌在肉芽腫內(nèi)環(huán)境的條件，如缺鐵、缺氧、缺營養(yǎng)等是最近幾年集中研究的重點[7]。Wayne 等通過逐漸減少氧氣，改變細(xì)菌的呼吸而產(chǎn)生硝酸還原作用，鑒定出可被厭氧誘導(dǎo)的與休眠相關(guān)的基因hspX(Rv2031)[16]。近年來全基因組芯片研究表明，厭氧條件下100多個基因的表達(dá)發(fā)生改變，其中DosR調(diào)節(jié)子包含48個基因，與hspX具有協(xié)同作用[17]。

蛋白質(zhì)組學(xué)和基因芯片分析表明，在宿主體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的許多脂代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生了改變，如鼠肺內(nèi)長期存活的結(jié)核分枝桿菌表達(dá)異檸檬酸裂合酶，這是一個脂肪酸代謝必需的酶。結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的代謝顯著受宿主反應(yīng)的影響，因為激活的巨噬細(xì)胞能更有效地剝奪細(xì)菌的營養(yǎng)，為了抵制吞噬體運(yùn)輸?shù)母淖?，?xì)菌關(guān)閉了脂肪酸的降解代謝途徑[11]。這些研究的深入將為針對休眠菌的疫苗設(shè)計提供重要指導(dǎo)。

2.1.1結(jié)核分枝桿菌的分泌性抗原Ag85復(fù)合體包括3種蛋白成分——Ag85A、Ag85B和Ag85C，它們是主要的分泌性抗原，也是目前在結(jié)核病疫苗研究中最受關(guān)注的抗原。在Ag85A 抗原中，P242-250是MHCⅠ類限制性CD8+T細(xì)胞的識別位點，在抗結(jié)核病的保護(hù)性免疫中，CD8+T細(xì)胞也發(fā)揮重要作用。另一個重要蛋白質(zhì)抗原ESAT6是早期分泌蛋白，其基因在BCG中缺失，具有多個CD4+和CD8+T細(xì)胞結(jié)合位點，可激活有效的體液免疫和細(xì)胞免疫。

2002年吳雪瓊等用結(jié)核分枝桿菌H37Rv腹腔內(nèi)注射感染BALB/c小鼠建立模型，發(fā)現(xiàn)DNA疫苗治療組肺組織涂片細(xì)菌數(shù)和肺菌落計數(shù)均比對照組明顯減少，證實Ag85A DNA疫苗具有一定的免疫治療效果[18]。隨后，吳雪瓊等先后證實Ag85A、Ag85A/ESAT6嵌合型質(zhì)粒DNA與藥物聯(lián)合使用能顯著提高藥物對耐藥結(jié)核分枝桿菌感染的治療效果[19，20]。

江山等[21]探討了分別表達(dá)Ag85B、MPT64抗原的DNA疫苗對小鼠的治療作用。通過檢測器官載菌量以及脾淋巴細(xì)胞特異性IFN-γ、白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)、TNF-α的分泌水平等指標(biāo)，結(jié)合相關(guān)組織病理變化，發(fā)現(xiàn)Ag85B DNA疫苗對小鼠結(jié)核病有一定的免疫治療作用，可能通過增強(qiáng)宿主Thl型免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)TNF-α、IFN-γ共同升高而達(dá)到治療目的。

2.1.2結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞內(nèi)蛋白1999年，Lowrie等[9]首次將編碼麻風(fēng)分枝桿菌Hsp65的DNA疫苗用于小鼠結(jié)核病的治療，顯著降低了肺、脾中細(xì)菌數(shù)目。實驗結(jié)果表明，DNA疫苗能將Th2型免疫反應(yīng)向Th1型轉(zhuǎn)換。2005年Nuermberger等[22]用Hsp65 DNA疫苗和藥物化療(利福平、莫西沙星)治療結(jié)核潛伏感染的小鼠，發(fā)現(xiàn)Hsp65 DNA疫苗能增加莫西沙星的抗結(jié)核活性。Silva等[23]用Hsp65 DNA疫苗結(jié)合藥物治療BALB/c小鼠結(jié)核病，1個月就可顯著減少肺和脾結(jié)核分枝桿菌載量，6個月后肺中未檢測到結(jié)核分枝桿菌；同時還發(fā)現(xiàn)Hsp65結(jié)合藥物治療對結(jié)核分枝桿菌敏感株H37Rv和耐藥株同樣有效。

還有研究[24]表明，多肽與結(jié)核分枝桿菌家族的細(xì)菌蛋白融合表達(dá)對結(jié)核病有治療作用。首選的多肽是結(jié)核分枝桿菌中低氧壓引起的潛伏期上調(diào)表達(dá)的蛋白。融合多肽的組合包括ESAT-6、ESAT-6-Ag85B、TB10.4、CFP10、RD1-ORF5、RD1-ORF2、Rv1036、MPB64、MPT64、Ag85A、Ag85B(MPT59)、MPB59、Ag85C、19kDa 脂蛋白或MPT32。研究表明該疫苗既可用于治療，也可用于預(yù)防結(jié)核病。

2.2 表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原和細(xì)胞因子融合基因的疫苗

大量研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌抗原與宿主來源細(xì)胞因子等編碼基因的融合體顯示較好的免疫效果。Okada等[25]融合表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌 Hsp65與IL-12編碼基因，采用日本紅細(xì)胞凝聚病毒包膜和脂質(zhì)體(Hsp65+IL-12/HVJ)為載體，在豚鼠結(jié)核分枝桿菌感染的治療中，顯著提高CD8+和CD4+T細(xì)胞的保護(hù)效率，減少耐藥結(jié)核分枝桿菌的數(shù)目，提高耐藥菌株感染豚鼠的存活率。在目前最好的結(jié)核病動物模型恒河猴中的研究表明，該疫苗表現(xiàn)出良好的治療效果(包括存活率和免疫反應(yīng))。這些數(shù)據(jù)表明該疫苗可能對感染結(jié)核分枝桿菌(包括廣泛耐藥菌株和多重耐藥菌株)的患者，具有治療作用。

Andersen等[24]構(gòu)建了一個DNA載體，以表達(dá)Hsp65與人IL-2融合基因，結(jié)果表明該疫苗提高了Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量IFN-γ和IL-2，激起高效價的抗Hsp65的抗原特異性IgG2a抗體。在用DNA疫苗治療結(jié)核病小鼠的實驗中，該疫苗能顯著降低結(jié)核分枝桿菌的數(shù)目，提高Th1型反應(yīng)[26]。

結(jié)核分枝桿菌Hsp70包含多個T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，免疫原性較Hsp65更強(qiáng)，能誘導(dǎo)出特異性Th1型反應(yīng)，對結(jié)核分枝桿菌的攻擊可產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)性免疫效應(yīng)。CD80(B7-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫活化功能的第二信號分子，與其共刺激受體CD28和(或)CTLA24 相互作用可提供T細(xì)胞活化所必需的協(xié)同刺激信號，對體液免疫和細(xì)胞免疫具有全面的活化作用。史小玲等用結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株攻擊小鼠后，接種Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗，結(jié)果表明該疫苗具有較好的免疫治療效果[27]。

2003年，Ha等[28]將Ag85A和IL-12N220L DNA疫苗聯(lián)合異煙肼和吡嗪酰胺治療C57BL/6J結(jié)核病小鼠，防止結(jié)核病復(fù)發(fā)的效果優(yōu)于IL-12N220L DNA疫苗與藥物聯(lián)合治療組，更優(yōu)于單純藥物組。

2.3 其他類型

RUTI由脂質(zhì)體包裹的結(jié)核分枝桿菌片段構(gòu)成，脂質(zhì)體由磷脂酰膽堿和膽堿鈉組成[10]。在鼠類模型中，感染結(jié)核分枝桿菌9～17周后采用異煙肼和利福平治療，并用RUTI 在17、19和21周進(jìn)行免疫治療，殘留的結(jié)核分枝桿菌數(shù)目顯著降低。在C57BL/6和DBA/2純系小鼠模型中，RUTI能調(diào)節(jié)Th1/Th2反應(yīng)的平衡。RUTI可在初期化療后使用，那時細(xì)菌載量已極大降低，RUTI可加快破壞殘留的細(xì)菌。在中止化療的感染實驗動物中，RUTI可顯著降低細(xì)菌載量，其作用機(jī)制可能是在治療動物肺內(nèi)產(chǎn)生CD8+IFN-γ+T細(xì)胞；RUTI也能產(chǎn)生很強(qiáng)的抗體反應(yīng)，對多種抗原肽產(chǎn)生IgG1、IgG2a和IgG3抗體。RUTI是針對潛伏結(jié)核分枝桿菌感染的治療性疫苗，與藥物化療聯(lián)合在治療結(jié)核病小鼠和豚鼠模型中非常有效，不存在毒性[29,30]。

江山等[21]研究表明，IL-12質(zhì)粒單獨(dú)用于治療小鼠結(jié)核病有一定作用。邵燕麗等[31]研究表明，IL-12、IL-18和IL-10都可用于免疫治療，且IL-18用作疫苗佐劑可能優(yōu)于IL-12。

日本科學(xué)家[32]發(fā)明了新型的治療性結(jié)核病疫苗，即采用腺病毒載體表達(dá)IL-6相關(guān)基因(IL-6 gene + IL-6 receptor gene + gp130 gene)。IL-6相關(guān)的DNA疫苗具有顯著的治療效果，能激發(fā)CTL活性，減少組織病理性結(jié)核壞死。采用該疫苗治療小鼠后，肺部結(jié)核分枝桿菌數(shù)目明顯低于BCG東京株，而且針對結(jié)核分枝桿菌的CTL活性明顯提高，肺部的組織病理學(xué)變化明顯改善。另外，他們還采用質(zhì)粒pcDLSR表達(dá)人源顆粒溶素cDNA，用該疫苗治療后，小鼠肺、脾和肝組織中的結(jié)核分枝桿菌數(shù)目明顯少于非治療組。目前他們正在研究兩者協(xié)同治療的效果。

3 治療性疫苗的載體及免疫策略

目前，治療性結(jié)核病疫苗主要是以質(zhì)粒為載體的DNA疫苗。隨著基因治療研究的深入及病毒載體應(yīng)用研究的較大進(jìn)展，病毒載體可在宿主體內(nèi)長期、穩(wěn)定地表達(dá)目的基因。

慢病毒載體具有能感染分裂和非分裂期細(xì)胞、容納外源性目的基因片段大、基因持續(xù)表達(dá)、免疫反應(yīng)小等特點，被廣泛應(yīng)用于癌癥的治療研究?；谌祟惷庖呷毕莶《?human immunodeficiency virus，HIV)的慢病毒載體已成為基因治療最有效的手段[33]。

腺病毒載體是非常有潛力的結(jié)核病疫苗載體，因為其具有定向性和強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞刺激作用[34]。然而5型腺病毒在人群中高度流行，感染后的個體將產(chǎn)生中和抗體，會削弱其高流行區(qū)的疫苗效率。35型腺病毒是非流行株，所以具有較為廣泛的用途。由于安全性高，重組腺病毒已被用作各種基因治療的載體。腺病毒對呼吸道上皮細(xì)胞有天然的高親和力，是呼吸道黏膜抗結(jié)核的理想載體。

電轉(zhuǎn)染也是一種有效的治療性疫苗的轉(zhuǎn)染技術(shù)。李忠明等[35]采用施加方型波電脈沖、促進(jìn)質(zhì)粒DNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法，研究了電轉(zhuǎn)染技術(shù)聯(lián)合初次免疫后加強(qiáng)免疫的策略能否增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌核酸疫苗的免疫原性。3次初次免疫后，用相應(yīng)抗原或BCG加強(qiáng)免疫，結(jié)果表明該策略能顯著增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌核酸疫苗在動物體內(nèi)的免疫原性。

4 結(jié)語

治療性結(jié)核病疫苗的發(fā)展優(yōu)勢在于針對常規(guī)治療無法徹底清除的潛伏期細(xì)菌和難以采用化學(xué)藥物治療的耐藥菌株，防止疾病復(fù)發(fā)。治療性疫苗可打破機(jī)體免疫耐受，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)，從而起到積極治療作用；可逆轉(zhuǎn)通常發(fā)生在疾病進(jìn)展期的非保護(hù)性免疫反應(yīng)，使其向Th1型反應(yīng)發(fā)展，從而治愈肺結(jié)核或作為佐劑縮短傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療的療程。

結(jié)核病是慢性傳染病，其生物學(xué)過程包括病原潛伏、免疫逃避機(jī)制或病原儲備機(jī)制。治療性疫苗的作用在于被接種后在宿主體內(nèi)仍能有效激發(fā)免疫反應(yīng)，但慢性感染患者通常表現(xiàn)為免疫防御受損。因此，真正的趨勢應(yīng)該是將化學(xué)藥物與治療性疫苗聯(lián)合使用，優(yōu)化在藥物治療過程中治療性疫苗的接種時間、接種次數(shù)等。

在疫苗設(shè)計上，治療性疫苗與傳統(tǒng)意義上的預(yù)防性疫苗具有顯著不同的特征。通常，預(yù)防性疫苗主要作用于從未感染的機(jī)體，因此天然結(jié)構(gòu)的微生物蛋白可直接用作疫苗抗原。而治療性疫苗的作用對象則是曾經(jīng)感染的個體，天然結(jié)構(gòu)的微生物蛋白一般難以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。但在多數(shù)微生物感染中，抗原呈遞細(xì)胞已被感染，因此需要設(shè)計與常規(guī)感染過程不同的抗原加工與處理途徑。治療性疫苗必須經(jīng)過分子設(shè)計和重新構(gòu)建，以獲得與原天然病毒蛋白結(jié)構(gòu)類似、但又不同的新的免疫分子。

疫苗研制屬高科技生物藥物開發(fā)范疇。 美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)的報告顯示，開發(fā)中的疫苗增長非常迅速，年增加品種達(dá)44%。國外權(quán)威專家預(yù)測，未來生物技術(shù)的“重磅炸彈”——生物藥品將由治療性疫苗等5類組成，因此研究與開發(fā)治療性疫苗將具有重大的理論意義及潛在的巨大經(jīng)濟(jì)和社會效益，已經(jīng)受到世界范圍的廣泛關(guān)注。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control: a short update to the 2009 report [R/OL]. http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/key_points/en/index.html.

[2] Heym B, Cole ST. Multi-drug resistance in Mycobacterium tuberculosis [J]. Int J Antimicrob Agents, 1997, 8(1): 61-70.

[3] Harris KA Jr, Mukundan U, Musser JM, Kreiswirth BN, Lalitha MK. Genetic diversity and evidence for acquired antimicrobial resistance in Mycobacterium tuberculosis at a large hospital in South India [J]. Int J Infect Dis, 2000, 4(3): 140-147.

[4] Choudhuri BS, Sen S, Chakrabarti P. Isoniazid accumulation in Mycobacterium smegmatis is modulated by proton motive force-driven and ATP-dependent extrusion systems [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 256(3): 682-684.

[5] Lawn SD, Wilkinson R. Extensively drug resistant tuberculosis [J]. Brit Med J, 2006, 333(7568): 559-560.

[6] Stop TB Partnership Working Group on New TB Vaccines. Tuberculosis Vaccine Candidates 2009[EB/OL]. Tuberculosis Vaccine Pipeline 2009. http://www.stoptb.org/wg/new_vaccines/assets/documents/TB Vaccine Pipeline 2009.pdf.

[7] Kaufmann SHE. Novel tuberculosis vaccination strategies based on understanding the immune response (Foresight) [J]. J Intern Med, 2010, 267(4): 337-353.

[8] 聞玉梅. 治療性疫苗研究現(xiàn)狀與前景[J]. 生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)，2009，(3):1

[9] Lowrie DB, Tascon RE, Bonato VL, Lima VM, Faccioli LH, Stavropoulos E, Colston MJ, Hewinson RG, Moelling K, Silva CL. Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination [J]. Nature, 1999, 400(6741): 269-271.

[10] Vilaplana C, Montané E, Pinto S, Barriocanal AM, Domenech G, Torres F, Cardona PJ, Costa J. Double-blind, randomized, placebo-controlled Phase I Clinical Trial of the therapeutical antituberculous vaccine RUTI [J]. Vaccine, 2009; 28(4): 1106-1116.

[11] Kaufmann SH. Is the development of a new tuberculosis vaccine possible [J] ? Nat Med, 2000, 6(9): 955-960.

[12] Aagaard C, Dietrich J, Doherty M, Andersen P. TB vaccines: current status and future perspectives [J]. Immunol Cell Biol , 2009, 8(4)7: 279-286.

[13] Cooper AM. Cell-mediated immune responses in tuberculosis [J]. Annu Rev Immunol, 2009, 27:393-422.

[14] Harty JT, Tvinnereim AR, White DW. CD8+T cell effector mechanisms in resistance to infection [J]. Annu Rev Immunol, 2000, 18: 275-308.

[15] Wong P, Pamer EG. CD8 T cell responses to infectious pathogens [J]. Annu Rev Immunol, 2003, 21: 29-70.

[16] Desjardin LE, Hayes LG, Sohaskey CD, Wayne LG, Eisenach KD. Microaerophilic induction of the alpha-crystallin chaperone protein homologue (hspX) mRNA of Mycobacterium tuberculosis [J]. J Bacteriol, 2001, 183(18): 5311-5316.

[17] Kendall SL, Movahedzadeh F, Rison SC, Wernisch L, Parish T, Duncan K, Betts JC, Stoker NG. The Mycobacterium tuberculosis dosRS two-component system is induced by multiple stresses [J]. Tuberculosis (Edinb), 2004, 84(3-4): 247-255.

[18] 吳雪瓊，張俊仙，李洪敏，史迎昌，張靈霞，梁建琴，金關(guān)甫，由昆. 結(jié)核分枝桿菌Ag85A DNA疫苗免疫治療作用的研究[J]. 中國免疫學(xué)雜志，2002，18(1)：17-22.

[19] 梁艷，吳雪瓊，梁艷，吳雪瓊，張俊仙，陽幼榮，王蘭，李洪敏，李忠明，史迎昌. 結(jié)核分枝桿菌Ag85A/ESAT-6嵌合型質(zhì)粒DNA疫苗和抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療小鼠耐藥結(jié)核病的效果研究 [J]. 中國防癆雜志，2007，29(5)：382-385.

[20] 梁艷，吳雪瓊，張俊仙，陽幼榮，王蘭，李洪敏，李忠明，史迎昌，陸陽.結(jié)核分枝桿菌Ag85A質(zhì)粒DNA疫苗和抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療小鼠耐藥結(jié)核病 [J]. 廣東醫(yī)學(xué)，2007，28(9)：1398-1400.

[21] 江山，朱道銀，駱旭東，蔣英，陳全. 結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗對小鼠結(jié)核病免疫治療作用的實驗研究 [J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28(5)：305-309.

[22] Nuermberger E, Tyagi S, Williams K N, Rosenthal I, Bishai WR, Grosset JH. Rifapentine, moxifloxacin, or DNA vaccine improves treatment of latent tuberculosis in a mouse model [J]. Am J Respir Crit Care Med, 2005, 172 (11): 1452-1456.

[23] Silva CL, Bonato VL, Coelho-Castelo AA, De Souza AO, Santos SA, Lima KM, Faccioli LH, Rodrigues JM. Immunotherapy with plasmid DNA encoding mycobacterial hsp65 in association with chemotherapy is a more rapid and efficient form of treatment for tuberculosis in mice [J]. Gene Ther, 2005, 12(3): 281- 287.

[24] Andersen P, Rosenkrands I, Stryhn A. Use of one or more polypeptides or their fragments, which are expressed during the latent stage of the mycobacterial infection, and/or nucleic acids encoding the polypeptides, for a therapeutic vaccine against tuberculosis: WO,2004006952-A2; US,2004057963-A1; AU,2003242504-A1; EP,1523331-A2; AU,2003242504-A8 [P/OL].http://apps.isiknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralSearch&qid=6&SID=2CH7e3MGG7e9E9pjGCF& page=1&doc=2&colname=DII.

[25] Okada M, Kita Y, Nakajima T, Kanamaru N, Hashimoto S, Nagasawa T, Kaneda Y, Yoshida S, Nishida Y, Nakatani H, Takao K, Kishigami C, Inoue Y, Matsumoto M, McMurray DN, Dela Cruz EC, Tan EV, Abalos RM, Burgos JA, Saunderson P, Sakatani M. Novel prophylactic and therapeutic vaccine against tuberculosis [J]. Vaccine, 2009, 27(25-26): 3267-3270.

[26] Changhong S, Hai Z, Limei W, Jiaze A, Li X, Tingfen Z, Zhikai X, Yong Z. Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 of Mycobacterium tuberculosis and the human interleukin 2 fusion gene [J]. Tuberculosis, 2009, 89(1): 54-61.

[27] 史小玲，李暉，鐘森，張建軍，鄧存良，黃永茂，盧潤生，吳建林，衛(wèi)幫富，蔣紹雙. Hsp70/ CD80 嵌合DNA 疫苗對結(jié)核桿菌的治療作用[J]. 中華傳染病雜志, 2004, 22(1): 30-33.

[28] Ha SJ, Jeon BY, Kim SC, Kim DJ, Song MK, Sung YC, Cho SN. Therapeutic effect of DNA vaccines combined with chemotherapy in a latent infection model after aerosol infection of mice with Mycobacterium tuberculosis [J]. Gene Ther, 2003, 10(18): 1592-1599.

[29] Cardona PJ, Amat I. Origin and development of RUTI, a new therapeutic vaccine against Mycobacterium tuberculosis infection[J]. Arch Bronconeumol, 2006, 42(1): 25-32.

[30] Cardona PJ. RUTI: A new chance to shorten the treatment of latent tuberculosis infection [J]. Tuberculosis, 2006, 86(3-4): 273-289.

[31] 邵燕麗，呂小華，呂世靜，黃羅佳，何德. 3 種白細(xì)胞介素與結(jié)核病免疫水平的關(guān)系[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)與臨床, 2008, 5(10): 577-580.

[32] Masaji Okada, Kita Y, Kanamaru N, Hashimoto S, Nishida Y, Nakatani H, Takao K, Kishigami C, Takamori Y, Saito I. Novel therapeutic vaccination (granulysin DNA, adenoviral vector/IL-6 related genes) against tuberculosis [J/OL]. http://www.fasebj.org/cgi/content/meeting_abstract/22/2_MeetingAbstracts/491.

[33] Draper SJ, Heeney JL. Viruses as vaccine vectors for infectious diseases and cancer [J]. Nat Rev Microbiol, 2010,8(1): 62-73.

[34] Bangari DS, Mittal SK. Development of nonhuman adenoviruses as vaccine vectors [J]. Vaccine, 2006, 24(7): 849-862.

[35] 宋丹，張穎，黃嘉璐，王曉一，何為，劉慶良，張洪勇，熊思東，李忠明.電轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合初免后加強(qiáng)免疫策略增強(qiáng)結(jié)核桿菌核酸疫苗免疫原性的研究[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2006, 26(2):127-131.