劉國榮，邱立朋，周延萌，辛?xí)悦?，髙允生

(1.蒼山縣人民醫(yī)院藥劑科，山東，臨沂 277700；2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東，泰安 271016)

杜仲多糖(Eucommia ulmoides Oliv Polysaccharides，EOP)是從杜仲科植物杜仲的干燥樹皮中提取的水溶性糖性成分，是近年來發(fā)現(xiàn)的杜仲又一活性成分。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)其有抗腫瘤[1]、免疫促進(jìn)[2]、抗炎[3]、提高機(jī)體的耐缺氧能力[4]等作用。

本次實(shí)驗(yàn)通過建立糖尿病小鼠模型，驗(yàn)證EOP的降糖作用，并初步探討其作用機(jī)制，為傳統(tǒng)中藥杜仲資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

昆明種小鼠，18～24g，♂♀各半，由泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：魯動(dòng)質(zhì)字070103)，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)3d。

1.2 主要儀器

Spectrumlab54紫外見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；電子分析天平FC104，奧豪斯(上海)公司；LXJ-IIB型低速大容量離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠；活力型血糖檢測(cè)儀(德國羅氏診斷公司)；活力型血糖試紙(德國羅氏診斷公司)。

1.3 主要試劑

EOP提取物(水提醇沉法制備，含量：55.24%)；消渴丸(廣州中一藥業(yè)有限公司，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z44020045)；四氧嘧啶(北京拜兒迪生物公司,批號(hào): A-7413)；其余試劑均為分析純；NO試劑盒，NOS試劑盒，考馬斯亮蘭試劑盒，SOD試劑盒，MDA試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 糖尿病小鼠模型的制備

將小鼠禁食12h(不禁水)，然后按250mg·kg-1ip 2%的四氧嘧啶溶液[5]。 3d后，禁食12h，尾尖采血，測(cè)其血糖含量，以空腹血糖大于10.0mmol·L-1者為糖尿病小鼠，模型不成功者，再次ip四氧嘧啶案300mg·kg-1，三天后，測(cè)其血糖含量，以空腹血糖大于10.0mmol·L-1者為糖尿病小鼠[6]，且出現(xiàn)糖尿病三多一少的癥狀，即多尿多飲多食體重減輕，得50只成功的糖尿病小鼠模型。

1.5 小鼠的分組及處理方法

將糖尿病小鼠按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為糖尿病模型組、消渴丸陽性對(duì)照組、EOP低劑量組(100mg·kg-1)、EOP中劑量組(200 mg·kg-1)、EOP高劑量組(400 mg·kg-1)。另以10只同批次健康小鼠作空白對(duì)照組。

空白對(duì)照組和糖尿病模型組以生理鹽水ig，陽性對(duì)照組以消渴丸ig，實(shí)驗(yàn)組以不同濃度的EOP溶液ig，容量均為(0.2ml·10g-1),連續(xù)10天。末次給藥后禁食(不禁水)3h，尾尖取血，測(cè)其空腹血糖。

1.6 指標(biāo)的檢測(cè)

1.6.1小鼠一般情況觀察

從實(shí)驗(yàn)開始每天觀察小鼠的皮毛、反應(yīng)、活動(dòng)和大便等一般情況。

1.6.2臟器指數(shù)的計(jì)算

小鼠眼球取血后處死，解剖分別取胸腺和脾臟，稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)。

胸腺指數(shù)=胸腺平均重量(mg)/小鼠平均體重(g)

脾臟指數(shù)=脾臟平均重量(mg)/小鼠平均體重(g)

1.6.3抗氧化和血管擴(kuò)張活性因子主要生化指標(biāo)的測(cè)定

按照各試劑盒說明書取5ul的血清測(cè)SOD，100ul的血清測(cè)MDA，10%肝組織勻漿上清測(cè)定NO和NOS。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況比較

造模前小鼠和正常對(duì)照組皮毛柔軟有光澤、反應(yīng)靈敏、活動(dòng)較多、大便成形。模型組小鼠出現(xiàn)三多一少等糖尿病癥狀，飲食、飲水和尿量增加，并出現(xiàn)皮毛無光澤、聳起、拱背、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、大便溏等癥狀。EOP治療組大部分小鼠上述癥狀基本消失或減輕，反應(yīng)較靈敏，活動(dòng)增多。

2.2 EOP對(duì)小鼠血糖和臟器指數(shù)的影響

模型組小鼠的血糖d10出現(xiàn)增高趨勢(shì)；與模型組比較，EOP低、中劑量組小鼠血糖明顯降低(P<0.01，P<0.05)，EOP高劑量能夠明顯升高糖尿病小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，見表1。

表1 杜仲多糖對(duì)小鼠血糖和臟器指數(shù)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 抗氧化和血管擴(kuò)張活性因子主要生化指標(biāo)的測(cè)定

模型組較正常對(duì)照組MDA 含量明顯升高，SOD含量明顯降低， NO含量明顯升高，NOS含量降低；EOP中、高劑量組能夠顯著降低小鼠血液中MDA 含量，升高SOD含量，EOP高劑量組能夠降低NO含量，升高NOS含量，見表2。

表2 杜仲多糖對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.01

3 討 論

本次實(shí)驗(yàn)兩次注射四氧嘧啶，成模率較高。成模后的小鼠完全符合糖尿病三高一低癥狀，食量、尿量以及飲水量明顯升高。

由表1看，模型組小鼠的血糖在實(shí)驗(yàn)過程中有增高趨勢(shì)，與模型組比較，EOP低、中劑量組小鼠血糖明顯降低，說明EOP有降低血糖的作用，尤其是低劑量降血糖作用顯著。

胸腺和脾臟是機(jī)體的免疫器官，胸腺和脾臟重量與體重的比值(即胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù))是衡量胸腺和脾臟功能正常與否的一項(xiàng)重要指標(biāo)[7]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可明顯看出(表1)四氧嘧啶致糖尿病各組與正常組小鼠相比，小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯下降，表明糖尿病可顯著抑制小鼠胸腺與脾臟的發(fā)育，對(duì)小鼠免疫功能損害嚴(yán)重。但是與糖尿病模型組相比，EOP則可提高小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)，表明EOP能提高小鼠非特異性免疫功能。

超氧化物歧化酶(SOD)對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，能清除超氧陰離子(O2-)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，因而SOD活性的高低與衰老、腫瘤、炎癥、自身免疫病、血液病和腎臟病都有密切聯(lián)系[8，9]。機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物，如丙二醛(MDA)等，丙二醛的含量常常反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞受傷程度。MDA的測(cè)定常與SOD的測(cè)定相互配合，SOD活性高低間接反映機(jī)體清除自由基的能力，而MDA的高低又反映了細(xì)胞受自由基攻擊的程度[10]。

表2顯示，糖尿病小鼠血清MDA含量明顯升高，同時(shí)，SOD活性明顯下降。通過ig不同劑量的EOP和消渴丸后，MDA含量有所下降，其中中劑量組和消渴丸陽性對(duì)照組下降最多；中劑量組和高劑量組SOD活性升高最為明顯。

NO由L-精氨酸和分子氧為底物經(jīng)NOS催化合成，是一種重要的免疫和炎性介質(zhì)，具有舒張血管、松弛血管平滑肌和抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖等多種生理功能，與糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[11]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型小鼠肝臟勻漿NO含量明顯升高，NOS活性降低不很明顯。經(jīng)ig給藥后，相對(duì)于模型組，陽性組和高劑量組肝勻漿NO含量均明顯降低；EOP高劑量組小鼠肝勻漿NOS活性有所增加，但是略低于消渴丸陽性組NOS活性的增加值。

由以上分析可知，EOP能夠降低糖尿病小鼠的血糖值，并且在一定程度上可升高糖尿病小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)，升高體內(nèi)SOD與NOS的活性，降低MDA與NO的含量，因此其降血糖作用機(jī)理可能與其提高糖尿病小鼠的免疫力與體內(nèi)抗氧化能力有關(guān)。

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