居紅格 蔣劍英 沈淑萍 耿 虹

(包頭醫(yī)學院病理學教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤亦稱膠質(zhì)細胞瘤，簡稱膠質(zhì)瘤(Gliomas)，是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其具有發(fā)病率高、復發(fā)率高、死亡率高和治愈率低的特點，主要原因是由于膠質(zhì)瘤的侵襲性生長，使其不能完全治愈。腫瘤的侵襲生長是一個多因素參與的復雜過程，而現(xiàn)在認為在腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長過程中起關鍵作用的是一類基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix-metallo-proteinase, MMPs)， MMPs是一組由結締組織細胞分泌的，依賴 Zn2+的蛋白酶家族，幾乎能降解細胞外基質(zhì)和基底膜(ECM)，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而MMPs的表達水平及其活性受多因子調(diào)節(jié)，尤其與細胞外基質(zhì)金屬酶誘導蛋白CD147和組織抑制物TIMPs的關系密切。本研究旨在探討 CD147、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在不同級別的腦膠質(zhì)瘤中的表達及其內(nèi)在的相互作用，進一步闡明膠質(zhì)瘤侵襲性生長的機制，從分子生物學水平，為臨床治療提供進一步理論基礎。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集包頭醫(yī)學院第一、三附屬醫(yī)院、包頭市二醫(yī)院病理科存檔的2002—2010年的石蠟組織標本78 例，經(jīng)病理學證實為膠質(zhì)瘤。所有病例臨床資料齊全，其中男48 例，女30例。平均年齡42.4( 7-78 ) 歲。按照2007年WH0神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準，將膠質(zhì)瘤按生物學行為分為4 級: I級21例，II級22例，III級20例，IV級15例。將I 、II 級歸為低級別組，III、I V級歸為高級別組。對照組12例取自非腫瘤患者。

1.2試劑與方法 采用免疫組化SP法。TIMP-2、TIMP-1 兔抗人CD147單克隆抗體濃縮型購自長島生物技術有限公司，鼠抗人MMP-1，MMP-2，MMP-9一抗和D A B顯色試劑盒均購自福州邁新公司。腫瘤標本常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后將標本置于PH6.0枸櫞酸緩沖液中進行抗原修復,PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，加過氧化酶阻斷劑，室溫孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，加血請室溫孵育20 min，甩干血清,滴加一抗,4 ℃冰箱孵育過夜， PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標記二抗，孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，最后滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液,室溫孵育10 min,PBS緩沖液沖洗3次5 min，DAB反應顯色后自來水充分沖洗、蘇木素復染。常規(guī)脫水、透明、干燥封片后鏡下觀察。分別用已知一抗表達陽性的乳癌和鱗癌切片作陽性對照,PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3結果判定標準 所有結果均經(jīng)過病理科兩位病理診斷醫(yī)師采用盲法進行確認。根據(jù)染色程度進行評分: 基本不著色給0 分，淡黃色給1分，棕黃色給2分， 深棕色給3分。每張切片隨機選取5個高倍視野(x4OO)， 計算出每個視野陽性染色腫瘤細胞的百分數(shù)，并取其平均值進行評分：陽性染色腫瘤細胞的百分數(shù)<1記為0 分，10% ～24% 記為1分，25%-49%記為2分，50%～74%記為3分，75% ～100%記為4分。最后將陽性率評分與強度評分相乘所得之積進行分級，0 分為(-)，1-4分為(+)， 5-8分為(+ +)， 9-12分為(+++),為該組織的免疫組化最終評分。

1.5統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。組間比較采用χ2檢驗,相關性檢驗采用Spearman相關分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義 。

2 結 果

2.1表達結果：CD147、MMP-1、MMP-2、MMP-9表達主要定位于細胞漿(見圖1)，在正常的腦組織中幾乎不表達，在膠質(zhì)瘤中的表達陽性率分別為62%，66%，64%，75%，隨著腫瘤的惡性程度升高，其表達水平和強度增加(見表1)。TIMP-1、TIMP-2表達主要定位于腫瘤細胞胞漿和血管內(nèi)皮細胞胞漿(見圖1)，在12例正常腦組織中1例TIMP-1表達(+)，2例TIMP-2表達(++)，在膠質(zhì)瘤中明顯表達，TIMP-1和TIMP-2的陽性表達率均為59%,并隨著腫瘤的惡性程度升高，它們的表達水平和強度也增加(見表1)。把腫瘤標本分為低級別組和高級別組，分別對這6個蛋白的表達進行χ2檢驗均具有統(tǒng)計學意義(見表2)。

表1 CD147 、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在膠質(zhì)瘤的病理分級中的陽性表達率

備注：括號內(nèi)為陽性表達例數(shù)。

表2 CD147 、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在膠質(zhì)瘤的臨床分級中的陽性表達率

2.2表達相關性 對本實驗免疫組化結果進行Spearmen相關分析： CD147、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的表達分別與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(rs=0.2671～0.5631，P<0.01)。但隨著惡性腫瘤程度增加，TIMP2/MMP-2, TIMP-1/MMP-9的比值降低(見表3)。CD147與MMP-1、MMP-2、MMP-9之間具有明顯的正相關關系(rs=0.3481～0.4951，P<0.01)。

表3 不同級別膠質(zhì)瘤中的TIMP2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9的比值

圖1 CD147、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達結果

3 討 論

膠質(zhì)瘤侵襲性生長涉及多個過程，其中細胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細胞侵襲的前提，MMPs與細胞外基質(zhì)降解密切相關，其屬于一大家族酶類系統(tǒng)，分為4類，即：1.間質(zhì)膠原酶；2.膠原酶；3.基質(zhì)溶解素；4.膜型金屬蛋白酶。MMP-1 又稱間質(zhì)膠原酶，可降解Ⅰ型膠原和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型纖維膠原。MMP-2又稱明膠酶A，是以ECM中的Ⅳ、Ⅴ型膠原及纖維粘連蛋白為主要底物。MMP-9可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原明膠和彈性蛋白等多種底物。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-1、MMP-2、MMP-9在膠質(zhì)瘤中的表達明顯增強，與對照組相比具有顯著性差異。MMPs的表達與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈明顯的正相關，其過度表達水平能反映出膠質(zhì)瘤的高侵襲性的生物學特性。MMPs陽性的腫瘤細胞呈片狀分布，且多位于腫瘤邊緣或血管腔旁，這為腫瘤細胞向周邊侵襲、 脫落又提供一理論依據(jù)。MMPs在高級別組和低級別組中的表達也具有顯著性差異，與國內(nèi)外報道的相一致[1-3，8,10]。這表明它們在膠質(zhì)瘤的侵襲過程中扮演著重要的角色，本研究發(fā)現(xiàn)在高級別組中，大多數(shù)MMP-9表達為(+++)，提示MMP-9 在膠質(zhì)瘤的侵襲生長中起更重要作用。

CD147是一個新的細胞表面粘附分子又名細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子，主要通過介導腫瘤細胞與間質(zhì)細胞的相互作用,刺激腫瘤細胞本身和間質(zhì)細胞分泌MMPs，降解ECM，促腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。本研究結果顯示CD147與膠質(zhì)瘤的惡性程度及MMPS的表達呈明顯的正相關，這說明CD147在膠質(zhì)瘤侵襲性過程中起重要的作用。

金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)是MMPs的天然抑制劑，目前已發(fā)現(xiàn) 4 種:TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3 和 TIMP-4。MMPs和TIMPs之間存在一定程度的特異性，TIMP-1能抑制大多數(shù)MMPs，但以選擇性的抑制MMp-9為主，而TIMP-2以特異性抑制MMP-2為主。TIMPs對MMPs的抑制作用主要表現(xiàn)在兩個方面，一是阻止MMPs酶原活化，二是抑制已活化MMPS的活性[5]。目前對于TIMPs在膠質(zhì)瘤中的表達研究結果不一致，甚至互相矛盾[3.6.7,9]。在本次研究中發(fā)現(xiàn)TIMPs在膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，但是但隨著惡性腫瘤程度增加，TIMP2/MMP-2, TIMP-1/MMP-9的比值降低。這表明隨著惡性腫瘤的程度增加，TIMPs相對于MMPs的分泌嚴重不足，MMPs的作用明顯增強，導致腫瘤的高侵襲性。

總之，本實驗結果表明，MMPs與膠質(zhì)瘤的侵襲性生長密切相關， 其過度表達水平能反映出膠質(zhì)瘤侵襲能力的生物學特性，它們的聯(lián)合檢測可以判斷腫瘤的惡性程度、 侵襲能力。目前抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的作用是已成為膠質(zhì)瘤治療的研究的熱點，主要從二個方面著手：一是抑制其活性，二是抑制其產(chǎn)生的數(shù)量。如果以MMPs的誘導劑 CD147為靶點從根本上阻止其產(chǎn)生，以及輔助性的應用MMPs的抑制劑，來降低殘留的MMPs酶的活性，可能會達到令人滿意的治療效果。

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