劉振忠 馮善龍 楊 柳 孔 偉 王新立 王慶寶

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000)

淋巴轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤獨(dú)有的惡性行為學(xué)特征，是影響惡性腫瘤進(jìn)展的重要因素。近年來，隨著淋巴管特異性標(biāo)記物D2-40、VEGFR-C、Podoplanin、 LYVE-1等陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，使淋巴內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞得以區(qū)別開來，對(duì)研究腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移起到了極大的促進(jìn)作用。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase COX)是花生四烯酸代謝的關(guān)鍵性限速酶，是一種膜結(jié)合蛋白，具有環(huán)氧合酶和過氧化物合成酶雙重酶的功能。研究發(fā)現(xiàn)Ang-2 可使腸系膜淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的Tie2 受體磷酸化, 促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，增殖作用[1]。兩者作為重要的淋巴管生長(zhǎng)因子，在淋巴管生成過程中均具有重要作用。本研究就Ang2和COX-2 在胃癌中的表達(dá)關(guān)系及其意義進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

48例胃癌標(biāo)本為泰山醫(yī)學(xué)院普外科2007年7月～2009年7月間行胃癌根治術(shù)的切除標(biāo)本，術(shù)后病理結(jié)果均為腺癌。所有病例術(shù)前均未化療、放療或激素治療。其中包括男40例，女8例，中位年齡57歲；TI期5例，T2期12例，T3期27例，T4期4例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

用免疫組織化學(xué)SP法，鼠抗人D2-40單克隆抗體，免疫組化單染試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物工程有限公司。將標(biāo)本制成層厚為4um連續(xù)切片，經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，水化，高壓修復(fù)，3%過氧化氫溶液，滴加山羊血清封閉后，滴加一抗(D2-40工作液，濃)，4 ℃過夜，PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗，甩去PBS液，滴加鏈霉菌抗生物素一過氧化物酶溶液，加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5分鐘，蘇木素復(fù)染30秒，溫?zé)酨BS沖洗返藍(lán)，經(jīng)梯度酒精脫水干燥二甲苯透明，中性樹膠封片。每批標(biāo)本染色過程中均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。淋巴管密度計(jì)數(shù)采用Wendner等[2]的方法，計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：先在低倍鏡(×40)下全面觀察切片，確定淋巴管密度最高處，即熱點(diǎn)。再在高倍鏡下(×200)計(jì)數(shù)D2-40陽(yáng)性的淋巴管數(shù)目。應(yīng)用多功能病理圖像分析儀計(jì)數(shù)每一份標(biāo)本5個(gè)視野內(nèi)的淋巴管個(gè)數(shù)，合計(jì)5個(gè)視野內(nèi)淋巴管均數(shù)作為該部位的MLVD。

1.3 RT-PCR

選取基因保守序列，應(yīng)用Primer5軟件，設(shè)計(jì)目的基因COX-2、Ang-2以及內(nèi)參基因β-actin引物，由上海英濰捷基生物工程技術(shù)有限公司合成。引物具體序列：COX-2上游引物TCG CCC TCC CAT CCC TAC GC，下游引物AGA GGG GGT AGA GGG GGT GCT (477bp)； Ang-2上游引物CGC CGC TCG AAT ACG ATG A，下游引物CGT CTG GTT CTG TAC TGC ATT(158bp)；β-actin上游引物CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA，下游引物AAG GGA CTT CCT GTA ACA ATG CA(148bp)。按試劑盒說明提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5分鐘；94 ℃變性30秒，退火溫度退火30秒， 72 ℃延伸45秒，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10分鐘。2%瓊脂糖凝膠電泳后，在成像分析系統(tǒng)上統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±Sd)表示，t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料結(jié)果用χ2檢驗(yàn)。P<0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 COX-2、Ang-2在胃癌中的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：39例COX-2mRNA高表達(dá)胃癌中有25例Ang-2mRNA陽(yáng)性表達(dá)，14例陰性表達(dá)；9例COX-2mRNA陰性表達(dá)胃癌標(biāo)本中有3例Ang-2mRNA陽(yáng)性表達(dá)，6例陰性表達(dá)。在胃癌組織中COX-2與Ang-2的表達(dá)明顯具有相關(guān)性。

2.2 胃癌中COX-2，Ang-2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間關(guān)系。

COX-2表達(dá)與胃癌TNM臨床病理和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，Ⅲ+IV期病例的COX-2表達(dá)率顯著高于I+Ⅱ期病例。與病人的年齡，腫瘤部位，腫瘤大小無關(guān)。Ang-2表達(dá)與胃癌TNM臨床病理TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與其他臨床病理資料無明顯相關(guān)。不同臨床病理生物學(xué)指標(biāo)的胃癌COX-2、Ang-2表達(dá)情況見表1。

2.3 COX-2，Ang-2的表達(dá)與MLVD之間的關(guān)系

COX-2陽(yáng)性表達(dá)組淋巴管密度平均為14.18±2.23個(gè)，高于陰性表達(dá)組淋巴管密度12.49±1.23個(gè)，MLVD在COX-2陽(yáng)性表達(dá)胃癌標(biāo)本中的表達(dá)率高于COX-2陰性表達(dá)的胃癌標(biāo)本(t=2.189，P<0.05)。Ang-2陽(yáng)性表達(dá)組淋巴管密度平均為14.76±1.98個(gè)，高于陰性表達(dá)組淋巴管密度12.60±1.83個(gè)。MLVD在Ang-2mRNA陽(yáng)性表達(dá)胃癌標(biāo)本中的表達(dá)率高于Ang-2陰性表達(dá)組的胃癌標(biāo)本(t=3.882，P<0.05)，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 胃癌組織中COX-2、Ang-2表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間關(guān)系

表2 胃癌組織中COX-2，Ang-2的表達(dá)與MLVD之間的關(guān)系

圖1 D2-40在胃癌癌旁組織中的表達(dá)(×200)

圖2 COX-2在胃癌組織的表達(dá)電泳圖

圖3 Ang-2在胃癌組織的表達(dá)電泳圖

3 討 論

環(huán)氧合酶是花生四烯酸(AA)合成前列腺素(PGs)過程中一個(gè)重要的限速酶，作為一個(gè)重要的生化調(diào)節(jié)因子及多效酶，其具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管形成、增強(qiáng)細(xì)胞活動(dòng)性等多種功能，參與體內(nèi)包括炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展等在內(nèi)的多個(gè)生理病理過程，參與了胃癌的形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等多種過程。COX-2的高表達(dá)與胃癌血管生成和淋巴管生成密切相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)COX-2可上調(diào)VEGF-C等基因[3、4]，但這不能充分解釋COX-2促進(jìn)腫瘤淋巴管生成的機(jī)制，因此推測(cè)可能還有其他一些基因起作用。

血管生成素(Angiopoietins, Ang)是一族分泌型的細(xì)胞因子，因?yàn)槟艽龠M(jìn)血管生成，故被命名為血管生成素。Ang-2可競(jìng)爭(zhēng)性拮抗Ang-1的作用，其通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ang-1與受體酪氨酸激酶Tie2 的相互作用參與血管重塑和血管內(nèi)膜去穩(wěn)定的過程[5]，遺傳學(xué)表明，Ang2也是在淋巴管發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用[6]，研究還發(fā)現(xiàn)Ang1 和Ang2 均可使牛腸系膜淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的Tie2 受體磷酸化，從而誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[1]。

以往對(duì)COX-2、 Ang-2的研究主要在促進(jìn)腫瘤血管生成方面，兩者在腫瘤淋巴管生成方面有無協(xié)同作用研究較少，兩者的表達(dá)與胃癌淋巴管生成間有無關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，COX-2、 Ang-2在胃癌中均高表達(dá)，且兩者之間具有正相關(guān)關(guān)系。這與國(guó)外研究相一致[7]。結(jié)合臨床病理資料，我們發(fā)現(xiàn)COX-2、 Ang-2的表達(dá)均與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM臨床分期有關(guān)，提示COX-2可影響Ang-2在胃癌中的表達(dá)，特別在缺氧狀態(tài)下，刺激細(xì)胞中Ang-2水平升高，從而共同影響胃癌的生物學(xué)行為，COX-2抑制劑影響胃癌細(xì)胞Ang-2的表達(dá)從側(cè)面也證實(shí)了COX-2上調(diào)Ang-2在胃癌中的表達(dá)[8]。

我們通過檢測(cè)48例胃癌組織中COX-2、Ang-2的表達(dá)及癌旁組織淋巴管密度，評(píng)估淋巴管密度與COX-2、Ang-2相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)COX-2表達(dá)陽(yáng)性組淋巴管密度高于COX-2表達(dá)陰性組，Ang-2陽(yáng)性組淋巴管密度明顯高于Ang-2陰性組。MLVD作為反映胃癌微淋巴管生成狀況的指標(biāo)，提示COX-2、 Ang-2的表達(dá)在促進(jìn)腫瘤周圍淋巴管新生過程中起重要作用。

作為重要的促淋巴管生成因子， COX-2與Ang-2誘導(dǎo)腫瘤組織淋巴管新生的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。如果能徹底闡明兩者在胃癌腫瘤淋巴管新生過程中的具體作用機(jī)制，將對(duì)胃癌抗腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移的臨床治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

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