黃麗華 姜樹原 張 勝 邵 國，2,3

(1.包頭醫(yī)學院生物醫(yī)學研究中心 ，內蒙古 包頭 014010；2.包頭醫(yī)學院生物化學及分子生物學教研室，內蒙古 包頭 014010；3. 汕頭大學醫(yī)學院分析細胞學實驗室，廣東 汕頭 515041)

低氧預適應(hypoxic preconditioning)是指1次或多次短暫、非致死性低氧刺激后,機體獲得的對更嚴重甚至致死性缺血或缺氧的耐受性。預適應是機體抗缺氧或缺血的一種內源性保護現象,它不僅存在于多種動物的心臟,而且也存在于肝、腎和腦等多種組織、器官和細胞中[1, 2]。腦是對低氧最敏感的器官,但經過預適應后也可以增加對低氧的耐受[3]。與氧密切相關的運輸和儲存這一生理過程中，人們認識到血紅蛋白和肌紅蛋白的功能。2002年德國科學家Burmester在小鼠和人體內發(fā)現了第四種攜氧球蛋白-細胞紅蛋白[4]。大量文獻表明細胞紅蛋白與缺氧關系密切，但細胞紅蛋白在低氧預適應中是否具有一定的作用，尚未見報道。本文通過復制小鼠急性重復低氧模型，詣在探討低氧過程中小鼠海馬中細胞紅蛋白的變化和意義。

1 材料與方法

1.1動物模型復制 選擇6～8周齡，體重18-22克的昆明種雄性小鼠有由內大動物室提供。按呂國蔚教授方法復制急性重復低氧預適應模型[5]。將小鼠置于含有新鮮鮮空氣，經過標定約125 ml的廣口瓶內，以橡皮塞密閉，記時、觀察，待小鼠出現喘呼吸，翻轉反射消失，立即取出，轉移至另一相同容積并含有新鮮空氣的廣口瓶內，密閉、記時，如此重復4次。實驗分3組：空白對照組(H0)、實驗對照組(H1)、低氧預適應組(H4)每組15只，各組取出后立即斷頭，迅速取出海馬并置于低溫冰箱中保存。

1.2儀器與試劑 TRIzol試劑(GIBCO BRL),Fluoro DD試劑盒(Genomyx) 溴化乙錠(EB)、氯仿(重慶化學試劑廠)、異丙醇( 重慶化學試劑廠)、乙醇 (重慶化學試劑廠) PCR儀：PTC-100美國；紫外分光光度計(U-2800日本日立)電泳儀(DF-D北京)、紫外透射反射分析儀(H-UVIII上海康禾)、Real-time PCR儀(ABI 7900)．

1.3Real-time 用Triziol法提取總RNA,然后用反轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄生成cDNA。取上述樣本1μL為模板,上游引物和下游引物各1μL(10mM)，利用南京凱基Real- PCR試劑盒檢測細胞紅蛋白表達。以β-actin作為內參，循環(huán)條件為50℃，20min, 95℃，2min,95℃,20s,59℃ ，1min 擴增40個循環(huán),最后72℃延伸7min。PCR引物序列如下：cytoglobin forward primer : 5-CCATCCTGGTGAGGTTCTTT-3【5 3右上角加撇】;cytoglobin backward primer: 5-CTTCCTTGTAGGCTGCGGT-3;β -actin forward primer:5 _ -GAACG GTGAAGGCGACAG-3;β-actin backward primer: 5 _ -TTGG GAGGGTGAGGGACT-3

2 結 果

2.1不同低氧次數小鼠耐受時間的比較。結果見圖1,由圖1可以看出隨低氧次數的增加小鼠的低氧耐受性增強，經過4次低氧處理的小鼠組對低氧的耐受性顯著提高。結果與以往發(fā)表文章相同[6, 7]。

圖1 不同低氧暴露次數低氧耐受時間(注： 與低氧一次比較**P< 0. 01)

2.2Real-time PCR結果 通過real-time PCR檢測發(fā)現，如圖2所示，以β-actin 為內參得到各組相對值H0組為(23±4.9),H1組為(33.85±6.4), H4組為(38.6±10.24)。我們可以看出隨低氧次數的增加細胞紅蛋白mRNA表達呈逐漸增高的趨勢。實驗組小鼠海馬組織細胞紅蛋白mRNA的表達高于未經低氧的對照組。低氧預適應組小鼠海馬組織細胞紅蛋白mRNA的表達顯著高于對照組，并有統(tǒng)計學差異(n= 3,P<0.05)

圖2 Ratio of cytoglobin mRNA to beta-actin mRNA in the hippocampus (n=3,*,P<0.05 vs.H0 and H1)

3 討 論

氧是機體代謝和維持生命的重要物質，在與氧密切相關的運輸和儲存這一生理過程中，人們認識到血紅蛋白和肌紅蛋白的功能。2002年德國科學家Burmester在小鼠和人體內發(fā)現了第四種攜氧球蛋白-細胞紅蛋白[4]。自從細胞紅蛋白發(fā)現以來，缺氧與細胞紅蛋白關系成為研究熱點，但細胞紅蛋白在急性低氧預適應的形成是否有作用尚未見報道。

本實驗對在低氧預適應中細胞紅蛋白是否發(fā)揮作用作出初步探討。研究結果顯示，低氧預適應形成的過程中，Cygb表達逐漸增加。其變化的原因可能是基于缺氧誘導因子-1 (HIF-1)的變化。我們先前研究發(fā)現急性重復低氧激活缺氧誘導因子-1 (HIF-1)[7]， 而Wystub等分析了Cygb啟動子區(qū)的調控因子，發(fā)現Cygb具有與HIF-1特異位點起作用的低氧應答元件 (HREs)，并且在它的3’端非翻譯區(qū)發(fā)現了保守的可經缺氧誘導的mRNA信號位點。因此在預適應形成的過程中，HIF-1促進了Cygb基因的轉錄，使細胞紅蛋白得以高表達。Cygb表達增加可以通過以下幾種機制對神經細胞保護：①Cygb同neuroglobin一樣可以增加供氧量[8]，以利于神經細胞在缺氧環(huán)境中仍能攝取足夠的氧氣分子，以滿足其功能的需要；②可以降低NO[9]，在缺氧/ 缺血期間產生過量NO 能激活周圍(如突觸前神經末梢和膠質細胞)的鳥苷酸環(huán)化酶,使cGMP 水平增高而產生毒性，對神經元存活有不利影[10]。由于Cygb能與NO緊密結合,有助于NO的清除[9]。③Cygb具有清除活性氧類物質的作用，腦缺血缺氧時,活性氧產生過多,自由基生成,細胞膜磷脂受其攻擊導致脂質過氧化,細胞膜流動性降低、通透性增高,線粒體腫脹,溶酶體受損并釋放等一系列變化。④Cygb具有作為NADH氧化酶的作用，在缺氧條件下促進糖酵解和ATP的生成，增加細胞供能，有助于維持正常神經元的功能。因此Cygb在低氧預適應小鼠海馬中表達可能是低氧預適應的形成和腦組織保護的機制之一。

自從細胞紅蛋白發(fā)現以來，尤其是細胞紅蛋白在缺氧時表達會增加，有助于神經細胞對缺氧提高耐受性。我們對低氧預適應過程中是否細胞紅蛋白發(fā)揮作用作出初步探討。雖然細胞紅蛋白在腦低氧預適應中作用機制尚不十分清楚，但是隨著研究的日益深入，人類會認識這種潛在的機制，將會對臨床醫(yī)學、高原醫(yī)學、運動醫(yī)學和航天醫(yī)學的發(fā)展起到推動作用。

[1] Webster KA, Discher DJ, Bishopric NH. Cardioprotection in an in vitro model of hypoxic preconditioning[J].J Mol Cell Cardiol, 1995,27: 453-458.

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