蔣海強(qiáng) 聶 磊 李運倫

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心，濟(jì)南 250335; 2.山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250011；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院高血壓中醫(yī)臨床研究基地，濟(jì)南 250011)

代謝組學(xué)的原理和技術(shù)是研究中醫(yī)證侯本質(zhì)的重要技術(shù)平臺[1]，能夠從代謝網(wǎng)絡(luò)終端表象的整體角度反映生物體的功能水平[2]，揭示生物體的病理生理變化實質(zhì)和機(jī)制[3，4]，而高效液相色譜(HPLC)分析是代謝組學(xué)研究中采用的技術(shù)之一，適合分離代謝產(chǎn)物中的復(fù)雜成分而后進(jìn)行檢測。為了研究高血壓病肝陽上亢證患者和健康志愿者血清成分圖譜的差異，尋找可能的生物標(biāo)記物,揭示高血壓病肝陽上亢的證候本質(zhì)，筆者采用高效液相色譜結(jié)合主成分分析(PCA)方法，對高血壓病肝陽上亢證患者和健康志愿者的血液成分譜進(jìn)行了分析和模式識別。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，配有四元泵，DAD 檢測器，自動進(jìn)樣器，美國Agilent 公司；

電噴霧離子阱型質(zhì)譜儀：Agilent 6300型，美國Agilent 公司，

電子天平：FA1104 型，上海精天電子儀器廠；

甲醇：美國 Tedia公司；

冰乙酸：美國 Tedia公司；

實驗用水為娃哈哈純凈水;

實驗對象：根據(jù)《1999 WHO/ISH高血壓治療指南》的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]和中醫(yī)肝陽上亢證的辯證標(biāo)準(zhǔn)[6]，選擇知情同意、志愿受試、經(jīng)過2周“洗脫期”后舒張壓在90～109 mmHg的2級高血壓病肝陽上亢證患者10例，同時選擇健康志愿者12例，兩組在年齡、性別分布方面無差異(P<0.05)。

1.2 實驗方法

(1)血清樣品預(yù)處理

清晨取空腹靜脈血，抗凝，取抗凝處理的血漿樣品適量,以4 000 r/min離心10 min。取上清液，精密移取300 μL，加入600 μL的甲醇，混勻器混勻10 min，然后于4℃，以14 000 r/min，高速離心10 min。取上清液，用0.45 μm濾膜過濾，制得供試樣品，低溫冰箱保存。

(2)色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18，美國安捷倫公司;流動相：0.2%冰乙酸-甲醇，流速為1.0 mL/min；檢測波長： 254 nm；進(jìn)樣量：20 μL；色譜圖采集時間不少于73 min；洗脫梯度見表1。

表1 洗脫梯度

(3)質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，正離子模式檢測；霧化氣壓力：103.4 kPa(15 psi)；干燥氣流量：5 L/min；干燥溫度：325℃；毛細(xì)管電壓：3 000 V；質(zhì)量掃描范圍：50～1 000m/z。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝指紋圖譜方法學(xué)考察

(1)空白溶劑考察

取供試品制備所用甲醇，按照梯度洗脫條件進(jìn)樣，試驗結(jié)果表明試劑無干擾。

(2)精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(高血壓病肝陽上亢證患者)，重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行分析，考察儀器的精密度；取同一患者血漿，分別制樣6份，進(jìn)行色譜分析，考察方法的重復(fù)性；取同一供試品溶液(高血壓病肝陽上亢證患者)，分別放置0、1、2、4、8、12、24 h后，進(jìn)行色譜分析，考察樣品的穩(wěn)定性。將所得數(shù)據(jù)采用國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件進(jìn)行處理，結(jié)果表明，其相似度均高于0.9。

2.2 高血壓病肝陽上亢證HPLC色譜指紋圖譜的建立

分別取高血壓病肝陽上亢證病人和健康志愿者的血漿，按照1.2所述方法制備供試品溶液，然后注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，建立高血壓病肝陽上亢證病人血清指紋圖譜，10個高血壓病肝陽上亢證病人血清樣品的色譜圖見圖1。

圖1 高血壓病肝陽上亢證病人血清高效液相色譜指紋圖譜

2.3 主成分分析

對色譜圖進(jìn)行積分獲得各色譜峰保留時間、峰面積的信息，色譜數(shù)據(jù)輸出得到AIA格式的文件，導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，對齊、匹配各色譜峰，輸出excel格式數(shù)據(jù)文件，匹配的數(shù)據(jù)進(jìn)行了百分比歸一的正規(guī)化處理，以消除血清濃度對樣本分類的影響。首先采用t-test對色譜峰進(jìn)行逐個檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在70個色譜峰中有3個色譜峰在兩類間具有顯著性差異(α=0.05)?；谶@3個特征峰，構(gòu)成20×3矩陣，導(dǎo)入Matlab軟件，進(jìn)行行主成分分析，其PCA得分圖如圖2所示。兩個主成分得分分別是PC1：60.545 6%和PC2:29.376 1%，二者之和大于85%，符合主成分分析變量得分的要求，除了1和4號患者樣本混于健康志愿組中，其余樣本已基本分開。

圖2 基于3個特征峰高血壓病樣本與正常樣本的PCA得分圖

為探討由t-test選取的特征峰對兩類樣本劃分的貢獻(xiàn)，根據(jù)t-test選取的特征峰，構(gòu)成20×3矩陣，作相應(yīng)的負(fù)載圖(圖3)，探討3個成分對高血壓病肝陽上亢組和健康志愿組分類的影響，離圖的中心越遠(yuǎn)，對分類的影響越大。由圖3可知，3個峰中峰3對兩組分類的影響最大，峰1和峰2次之，峰3、峰1和峰2對應(yīng)的特征峰(RT分別為15.520、14.484、15.096 min)對劃分兩類樣本具有重要的貢獻(xiàn)，因此可以利用相應(yīng)的質(zhì)譜圖對這些起重要作用的色譜特征峰進(jìn)行解析，以探究其物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖3 主成分負(fù)載圖

2.4 特征峰質(zhì)譜分析

保留時間15.520、14.484、15.096 min特征峰所對應(yīng)質(zhì)譜圖m/z列于表2。

表2 特征峰的保留時間及m/z

血清樣品的高效液相色譜PCA結(jié)果表明，高血壓組和健康志愿者組在積分值散點圖中呈聚類分布，兩組基本分開。對PC1和PC2進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，高血壓病肝陽上亢證患者體內(nèi)代謝成分有明顯差異。由于本實驗所用離子阱質(zhì)譜為低分辨型質(zhì)譜，未能確定化合物的分子式及結(jié)構(gòu)，需經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測后方可確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜和主成分分析的方法研究高血壓病肝陽上亢證，對高血壓病肝陽上亢病人和健康志愿者血清樣品進(jìn)行分析和模式識別，同時進(jìn)行了標(biāo)記物尋找，經(jīng)質(zhì)譜測定，基本能確定其分子量。結(jié)果顯示，盡管在高血壓病肝陽上亢病人和無癥狀高血壓病患者各自組內(nèi)，血清成分存在個體差異，在一定程度上造成了兩組樣本的交叉，但從PCA的得分圖可以看出，兩組樣本基本能夠分開，且類別清晰、明確。

該項工作有利于深入認(rèn)識和理解高血壓病肝陽上亢證的本質(zhì)，同時為該類疾病的臨床診斷和治療研究提供依據(jù)。血清代謝組學(xué)分析能夠較好地反映高血壓病肝陽上亢證的代謝特征，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合模式識別的代謝組學(xué)方法可用于研

究復(fù)雜條件下機(jī)體病理生理狀態(tài)變化，揭示中醫(yī)癥候本質(zhì)。

[1] 李運倫.代謝組學(xué)是研究證候?qū)嵸|(zhì)和方劑原理的重要技術(shù)平臺[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，32(3)：187-189.

[2] Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. Metabonomics：Understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuliviamultivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica,1999,29:1 181-1 189.

[3] 周明眉,劉平,賈偉,等.基于代謝網(wǎng)絡(luò)變化的中藥整體效應(yīng)評價方法研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2006,8:113-119.

[4] 賈偉,蔣健,劉平,等.代謝組學(xué)在中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系研究中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志,2006,31:621-624.

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[6] 鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2002:73-76.