楊中純 肖自安 謝鼎華

耳聾是引起交流障礙最常見的疾病，新生兒中先天性重度以上耳聾的發(fā)病率高達(dá)1/1 000，其中一半是遺傳因素所致[1]。GJB2 (gap junction protein β-2)基因缺陷是非綜合征型常染色體顯性遺傳性聾DFNA3和隱性遺傳性聾DFNB1以及合并感音神經(jīng)性聾的掌趾角化征的遺傳基礎(chǔ)，是最常見的耳聾基因[2]。GJB2基因編碼蛋白CX26為膜蛋白，4次跨越胞膜，有9個(gè)結(jié)構(gòu)域(區(qū)段)，包括3個(gè)胞內(nèi)段(N端IC1、胞內(nèi)環(huán)IC2、C端IC3)、4個(gè)跨細(xì)胞膜段(TM1、TM2、TM3、TM4)、2個(gè)胞外環(huán)(EC1、EC2)[3]，跨膜區(qū)和胞外環(huán)是高度保守的，而IC2和IC3段差異較大，IC1與TM1的細(xì)胞內(nèi)側(cè)段構(gòu)成電壓感受器的電荷復(fù)合體， EC1、EC2決定CX26與其他CX蛋白的相容性，IC2和IC3與間隙連接通道PH門控有關(guān)[4]。已發(fā)現(xiàn)的與耳聾相關(guān)的100余種GJB2突變覆蓋CX26的9個(gè)結(jié)構(gòu)域。本研究從CX26的9個(gè)結(jié)構(gòu)域中各選擇1個(gè)致聾錯(cuò)義突變(表1和圖1)，觀察突變體蛋白在HeLa細(xì)胞的表達(dá)及定位，為進(jìn)一步研究CX26致聾突變體組裝、運(yùn)輸和定位及間隙連接通信功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 pEGFP-N1載體、HeLa細(xì)胞和大腸桿菌Top10菌種由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。HeLa細(xì)胞是一種很容易離體培養(yǎng)的細(xì)胞，該細(xì)胞沒有內(nèi)源性的間隙連接表達(dá)，因此被廣泛應(yīng)用于間隙連接蛋白功能分析的體外實(shí)驗(yàn)[5]。Pyrobest 酶、dNTP 和限制性內(nèi)切酶EcoR、SalⅠ及 T4DNA 連接酶購自TaKaRa 公司(中國大連)；引物由上海博亞生物工程公司合成，普通瓊脂糖購自BIORAD公司(德國)，Perkinelmer 9600PCR 儀(ABI公司，美國)，BIORAD凝膠電泳儀(BIORAD公司，德國)，Eppendorf 臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，美國)。

1.2引物設(shè)計(jì) 見表1。

表1 CX26的9個(gè)突變體構(gòu)建的引物

注：下劃線堿基為酶切位點(diǎn)序列。p.S19T和P.L214P為長引物法構(gòu)建，只有1個(gè)引物，其余有雙向引物。p.CX26為野生型

圖1 CX26蛋白4次跨細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)拓?fù)鋱D及本研究中的9個(gè)結(jié)構(gòu)域上各1個(gè)錯(cuò)義突變

1.3CX26突變體的構(gòu)建 利用上述引物，overlap PCR法或長引物快速法構(gòu)建各個(gè)突變，用 EcoR I / Sal I 雙酶切野生型p.CX26 質(zhì)粒及各突變質(zhì)粒及pEGF-N1 載體后，回收純化雙酶切的野生型p.CX26 質(zhì)粒及各突變質(zhì)粒pEGF-N1 載體，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Top10，挑選重組克隆，用 EcoRI/ Sal I雙酶切經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，取初步篩選的陽性質(zhì)粒送上海生工技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序鑒定后QIAGEN-tip 100提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。

1.4CX26突變蛋白的Western blot分析 取培養(yǎng)細(xì)胞，棄培養(yǎng)基。加2XSDS sample buffer裂解細(xì)胞，超聲后，用蛋白定量試劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白濃度。各取20μg總蛋白經(jīng)12% SDS - 聚丙烯酰胺凝膠電泳，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)后，加入GFP單抗，4 ℃過夜，TBST洗膜后，加入對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠二抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜后，ECL發(fā)光，曝光。

1.5CX26突變體在HeLa細(xì)胞的定位觀察 取培養(yǎng)細(xì)胞，棄培養(yǎng)基。3.7%多聚甲醛 / PBS室溫固定15 min，PBS洗2次，每次5 min；0.2% TritonX-100 / PBS透化10 min，PBS洗2次，；5%BSA室溫封閉30 min；1∶200稀釋的GFP單抗室溫孵育60 min，PBS洗7次，每次5 min；5%BSA室溫封閉20 min；1∶400稀釋鼠cy3二抗40 μl，避光室溫孵育60 min；1×PBS洗5次，每次5 min。DAPI染細(xì)胞核，室溫，避光反應(yīng)2 min；PBS洗2次，每次5 min；去離子水洗一次，封片，熒光顯微鏡觀察，激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。

2 結(jié)果

2.1突變體的構(gòu)建 突變體與EGFP重組質(zhì)粒用EcoR I/ Sal I雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在近 750 bp和4 000 bp 處各有一條帶，分別對(duì)應(yīng)于突變蛋白和EGFP蛋白，說明突變片段已經(jīng)連接到克隆載體上(圖2)，DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)CX26突變體和野生型的重組載體序列未發(fā)生其它堿基序列改變。

2.2突變體在 HeLa細(xì)胞的表達(dá)和定位 突變?nèi)诤系鞍踪|(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞后，免疫印跡結(jié)果顯示CX26各突變體和野生型在HeLa細(xì)胞均表達(dá)(圖3)。 其中p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M、p.R165W突變體和野生型蛋白能轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜并形成間隙連接斑，而p.R32H、p.R143W、p.S199F、p.L214P突變體在細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫分布，不能轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，無間隙連接斑形成(圖4)。

圖2 CX26突變體重組質(zhì)粒EcoR I/ Sal I雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖a和b圖示p.S19T、p.V84L、p.V95M、p.E47K、p.R32H、p.L214P、p.GFP-N1、p.wtCX26、p.S199F、p.R165W和p.R143W突變體與pEGF的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I/ Sal I雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳在近 750 bp和4 000 bp 處各有一條帶，分別為插入的CX26和pEGF

圖3 CX26各突變體和野生型CX26與pEGF的重組體在HeLa細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)于接近49KD的條帶是融合蛋白，對(duì)應(yīng)于接近25KD的條帶是pEGF蛋白

3 討論

GJB2基因編碼的CX26在耳蝸表達(dá)于非感覺上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞，是感覺毛細(xì)胞興奮后K+回循環(huán)的路徑[6]。GJB2基因突變后，突變的CX26不能形成間隙連接或不能形成有功能的間隙連接，K+回循環(huán)障礙，從而導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾[7～9]。研究報(bào)道，CX26不同的錯(cuò)義突變蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位和功能改變不盡相同，如位于TM2結(jié)構(gòu)域的p.W77R突變蛋白只僅在細(xì)胞漿表達(dá)，不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜[10]；位于ICL結(jié)構(gòu)域的p.R127H在細(xì)胞膜表達(dá)，但組成的間隙連接功能受損[8]。

為了觀察CX26不同結(jié)構(gòu)域上的錯(cuò)義突變蛋白的表達(dá)、亞細(xì)胞定位和功能的改變，本文從CX26的9個(gè)結(jié)構(gòu)域上各選擇1個(gè)錯(cuò)義突變，構(gòu)建成與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)融合表達(dá)的載體，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，Western blot分析突變這些蛋白均在細(xì)胞中能翻譯和表達(dá)，通過觀察EGFP在細(xì)胞中的定位可確定CX26突變體在亞細(xì)胞器中的表達(dá)定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于IC1的p.S19T、EC1段的p.E47K、TM2段的p.V84L、IC2段的p.V95M、EC2段的p.R165W突變體和CX26野生型蛋白一樣在細(xì)胞膜表達(dá)并形成間隙連接斑，說明這5個(gè)突變體在HeLa細(xì)胞的核糖體合成后能夠聚合成半通道并被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，形成間隙連接斑。其導(dǎo)致耳聾的原因可能是所形成的間隙連接的通訊功能消失或下降，有待于對(duì)形成的間隙連接進(jìn)行功能分析來驗(yàn)證。Beltramello研究發(fā)現(xiàn)p.V84L突變蛋白對(duì)第二信使分子IP3通透性較野生型低[11]，Stong發(fā)現(xiàn)p.E47K組成的間隙連接無功能[12]，支持本文的推測(cè)。本研究還發(fā)現(xiàn)位于TM1的p.R32H、TM3的p.R143W、TM4的p.S199F、IC3的p.L214P突變體在細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫分布，在細(xì)胞膜無表達(dá)、無間隙連接斑形成，說明這4個(gè)突變體在核糖體合成后不能夠被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，因此細(xì)胞膜上無間隙連接斑形成，細(xì)胞間隙連接通訊功能缺失，導(dǎo)致耳聾。本研究還發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)IC1段p.S19T、p.IC2段p.V95M形成間隙連接，而IC3段p.L214P不能形成；細(xì)胞膜內(nèi)的TM2段p.V84L形成間隙連接，而TM1段p.R32H、TM3段p.R143W、TM4段p.S199F不能形成；胞外的EC2段p.R165W形成間隙連接，EC1段p.E47K不能形成；提示錯(cuò)義突變位點(diǎn)所處的CX26結(jié)構(gòu)域與突變蛋白功能改變無關(guān)。Stong報(bào)道EC1段的p.G45E在轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后導(dǎo)致細(xì)胞死亡，與同一結(jié)構(gòu)域中的p.E47K突變體出現(xiàn)的改變不同[12]，Martínez總結(jié)了文獻(xiàn)報(bào)道的CX26不同結(jié)構(gòu)域的29個(gè)錯(cuò)義突變體在體外細(xì)胞表達(dá)、定位和間隙連接功能[13]，也發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變功能改變與所處的結(jié)構(gòu)域無關(guān)，支持本文結(jié)論。

圖4 CX26野生型和突變體在HeLa細(xì)胞中表達(dá)后的共聚焦顯微鏡掃描圖(×400) a：WT(野生型CX26)、p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M和p.R165W突變體定位于細(xì)胞膜，并能形成間隙連接斑(黃色箭頭)。b：p.R32H、p.R143W、p.S199F和p.L214P突變體在細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫分布，細(xì)胞膜上無間隙連接蛋白表達(dá)及間隙連接斑形成

在本文所選擇的CX26的9個(gè)突變體中，已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其中的p.S19T[14]、p.E47K[12]、p.V84L[11]、p.V95M[15]、p.R143W[16,17]和p.L214P[17]共6個(gè)突變體進(jìn)行了類似研究，除p.R143W外，其余結(jié)果均與本研究基本一致。Wang等報(bào)道，p.R143W轉(zhuǎn)染N2A細(xì)胞后能在細(xì)胞膜上形成對(duì)熒示光蹤劑具有通透性的間隙連接[16]；Mese將p.R143W在蟾蜍卵細(xì)胞表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不能形成間隙連接[17]。Wang的發(fā)現(xiàn)與本研究在HeLa細(xì)胞中的結(jié)果完全相反，而Mese的結(jié)果與本研究的發(fā)現(xiàn)相似。這可能與CX26在核糖體翻譯后要經(jīng)過修飾并聚合成六聚體后才能轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜這一過程有關(guān)，不同的細(xì)胞中修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)的因素存在差異，形成間隙連接能力不一樣。

本文僅觀察了CX26突變體在HeLa細(xì)胞的表達(dá)和定位。在下一步研究中，將通過染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)及膜片鉗實(shí)驗(yàn)分析p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M和p.R165W突變蛋白所形成的間隙連接的通訊功能，并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體染色來觀察p.R32H、p.R143W、p.S199F和p.L214P突變蛋白在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程具體受阻的亞細(xì)胞部位，進(jìn)一步探討CX26致聾突變體組裝、運(yùn)輸和定位及間隙連接通信功能的影響機(jī)理。

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