楊 輝,王 鴻,鄧澤元,范亞葦,李 靜

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,高等研究院,江西南昌 330047)

山蕗菜,中文學(xué)名掌葉蜂斗菜 (Petasites tricholobus A.Gray),系菊科蜂斗菜屬植物,廣泛分布于我國(guó)西北、西南地區(qū)。山蕗菜原是一種野生蔬菜,食用部分為葉柄,一般于夏、秋季采挖根基,鮮用或曬干。蜂斗菜“苦辛,涼”,可“治扁桃體炎,癰腫療毒,毒蛇咬傷”,“消腫止痛,解毒祛癖,治跌打損傷”[1]。山蕗菜根中除了含有倍半萜內(nèi)酯、三萜類化合物[2]、粗纖維、揮發(fā)油等以外,還含有豐富的多糖類化合物。人工種植的山蕗菜根須布滿全田,根須每公頃可達(dá) 22.5 t左右,有的還達(dá)到 30 t以上。因此,作為一種傳統(tǒng)中草藥,山蕗菜根資源開(kāi)發(fā)利用潛能巨大。

植物采摘后,體內(nèi)的酶催化作用仍然在繼續(xù),直到酶系的底物耗盡或 pH不再適合反應(yīng)進(jìn)行時(shí)才終止。這個(gè)過(guò)程中,酶的活動(dòng)方向趨向于水解反應(yīng),各種成分都會(huì)發(fā)生變化。山蕗菜采收后,留在地里的根被水浸過(guò)以后,會(huì)很快腐爛,其速度比一般植物要快得多,這很可能是由于其自身的酶活力比較高,很容易水解自身物質(zhì)并被微生物利用所致。本文研究山蕗菜根主要酶的活性,為山蕗菜根的開(kāi)發(fā)及其酶的資源利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料

山蕗菜根采自江西九江地區(qū)。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定其蛋白質(zhì)、多糖和纖維素含量分別為 12.3%、30.4%和 19.9%。

1.1.2 儀器和試劑

722型分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司)、AR1140電子分析天平 (美國(guó)奧豪斯貿(mào)易公司)、Anke TDL-5-A低速大容量離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)、BD-86L低溫冰柜 (青島海爾特種電冰柜有限公司)、KDY-9820凱氏定氮儀 (廈門精藝科技有限公司)、DZT W調(diào)溫電熱套 (北京市永光明醫(yī)療儀器廠)、SK3310HP超聲清洗器 (上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、JYL-350A料理機(jī) (九陽(yáng)股份有限公司)、PHS-3C型 pH計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司);無(wú)水硫酸銅、氫氧化鈉、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、無(wú)水乙醇、葡萄糖、苯酚、重鉻酸鉀、淀粉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、醋酸、硝酸、福林試劑、DNS試劑、考馬斯亮藍(lán) (以上試劑均為分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間的變化

把新鮮山蕗菜根勻漿,取 10支離心管,分別加入 2 g勻漿液,在 40℃水浴中分別放置 0、0.5、1.0、1.5、2.16、2.83、3.5、4.5、5.5、7.0 h,立即放在沸水浴中滅酶 10 min,備用。用凱氏定氮儀測(cè)定各樣品的蛋白質(zhì)含量[3],每份做 3個(gè)平行。

1.2.2 多糖含量隨時(shí)間的變化

取 10支干凈試管,分別加入約 2.5 g勻漿液,在 40℃水浴中分別放置 0、0.5、1.0、1.5、2.16、2.83、3.5、4.5、5.5、7.0 h,立即放在沸水浴滅酶10 min。轉(zhuǎn)入圓底燒瓶,加 40 mL 80%乙醇 95℃回流 1 h,抽濾,濾渣用 40 mL水提取 2 h[4-5]。抽濾,濾液定容到 100 mL備用。用苯酚 -硫酸法[6]測(cè)定多糖含量,用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)方程:y=6.988 4x-0.011 3,其線性相關(guān)系數(shù) R2=0.998 8。

1.2.3 纖維素含量隨時(shí)間的變化

取 30支試管,分別加入 1.5 g勻漿液,均分成10組 ,每組在 40℃水浴中分別放置 0、0.5、1.0、1.5、2.16、2.83、3.5、4.5、5.5、7.0 h。按 72%硫酸水解法[7]測(cè)定纖維素含量。

1.2.4 酶的粗提及其濃度測(cè)定

取 250 g樣品,加磷酸緩沖溶液 (pH值 6.5),搗碎勻漿 (M∶V=1∶1),4層紗布過(guò)濾,濾液加硫酸銨至 20%飽和度,加 EDTA和維生素 C各 0.05 g,4℃下過(guò)夜,離心去沉淀,上清液加硫酸銨至 85%飽和度,離心得沉淀[8]。取部分沉淀溶于適量水中,用考馬斯亮藍(lán) G-250法[9]測(cè)定酶蛋白的含量。

1.2.5 蛋白酶總活力測(cè)定

參照福林法[10]測(cè)定蛋白酶活力。定義:在測(cè)定條件下 1 g粗蛋白 1 min內(nèi)經(jīng)酶分解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸表示一個(gè)活力單位。計(jì)算公式如下:

式中:A1為試樣吸光度;K1為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;V1為酶水解時(shí)的總體積(mL);T1為水解時(shí)間 (min);C為根提取液中酶平均濃度μg/mL。

1.2.6 多糖酶總活力測(cè)定

用 DNS法[11-12]測(cè)定多糖酶活力。定義:在測(cè)定條件下 1 g粗多糖 1 min內(nèi)經(jīng)酶分解自身多糖產(chǎn)生 1μg葡萄糖為一個(gè)活力單位。計(jì)算公式如下:

式中:A2為試樣吸光度;K2為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;V2為酶水解時(shí)的總體積(mL);T2為水解時(shí)間 (min);C為根提取液中酶平均濃度μg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量變化

山蕗菜根經(jīng)勻漿處理,放置不同時(shí)間其蛋白氮含量的變化情況見(jiàn)圖1。從圖中可以看出,前 0.5 h蛋白氮含量下降很快,相對(duì)含量減少 35%,1 h時(shí)減少了 41.58%,此后的 6 h蛋白氮含量下降很少。這表明蛋白酶在前 1 h內(nèi)活性很高,尤其是前 0.5 h;在 0.5 h～1 h之間,酶活性降低速度較快,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其活性降至較低。

圖1 蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間的變化

2.2 多糖含量變化

山蕗菜根經(jīng)勻漿處理,放置不同時(shí)間其多糖含量的變化情況見(jiàn)圖2。從圖中可以看出,多糖含量在前 2 h內(nèi)變化比較平穩(wěn),下降較快,相對(duì)含量減少26%左右,之后下降很小,3 h左右基本達(dá)到穩(wěn)定,此后多糖含量下降很少。這表明在前 2 h內(nèi)多糖分解酶活性較穩(wěn)定,活力也較大,之后活性降低,3 h后幾乎沒(méi)有活性。

圖2 多糖含量隨時(shí)間的變化

2.3 纖維素含量變化

山蕗菜根經(jīng)勻漿處理,放置不同時(shí)間其纖維素含量的變化情況見(jiàn)圖3。從圖中可以看出,纖維素含量在前 3 h內(nèi)變化比較平穩(wěn),下降較慢,此后纖維素含量變化較小,3.5 h后 (相對(duì)含量減少 3.8%左右)基本保持不變。這表明山蕗菜根中纖維素酶隨時(shí)間的延長(zhǎng)活性降低,而且與蛋白酶和多糖分解酶相比活性較低。因此,本文選擇活性較高的蛋白酶和多糖酶為研究對(duì)象測(cè)定其活性。

圖3 纖維素含量隨時(shí)間的變化

綜合圖1、2、3,可知在相同的時(shí)間內(nèi),蛋白質(zhì)含量的相對(duì)減少量大于多糖,多糖大于纖維素,說(shuō)明山蕗菜根的蛋白質(zhì)很容易被自身的酶作用,其次分別為多糖、纖維素。本文通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)、多糖和纖維素的含量隨時(shí)間的相對(duì)變化的研究可知,蛋白質(zhì)水解程度為 50%左右,多糖約為 26%,纖維素約為3.8%,而且水解速度蛋白質(zhì)大于多糖和纖維素,由此推出山蕗菜根蛋白酶活力高于多糖酶,纖維素酶的活性則較小。

2.4 酶提取液濃度測(cè)定

用牛血清蛋白溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到其標(biāo)準(zhǔn)方程為 y=0.000 4x+0.000 3,線性相關(guān)系數(shù) R2=0.994 1。將樣液吸光度折算成酶蛋白濃度,結(jié)果見(jiàn)表1,山蕗菜根提取液中酶蛋白平均濃度 (C)為23.83μg/mL。

表1 酶提取液蛋白質(zhì)含量

2.5 蛋白酶活性測(cè)定

用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其方程為 y=111.00x-24.601,R2=0.999 9,斜率 K1=111.00。把測(cè)得的吸光度值 A1、酶水解時(shí)的總體積V1(4 mL),水解時(shí)間 T1(10 min),根提取液中酶平均濃度 C(23.83μg/mL),代入 (1)式計(jì)算蛋白酶活力,得到平均活力為 24 221.57U/g蛋白 (表2)。

表2 蛋白酶活力

2.6 多糖分解酶活性測(cè)定

用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)方程為 y=1.135 9x+0.080 5,線性相關(guān)系數(shù) R2=0.994 3,斜率 K2=1.135 9。把測(cè)得的吸光度值 A2、酶水解時(shí)的總體積 V2(5 mL),水解時(shí)間 T2(30 min),根提取液中酶平均濃度 C(23.83μg/mL)代入 (2)式計(jì)算的多糖酶活力見(jiàn)表3,得到多糖酶平均活力為45 018.65U/g蛋白。

表3 多糖酶活力

3 討 論

本文通過(guò)研究山蕗菜根主要物質(zhì)含量隨時(shí)間的變化情況,側(cè)面反映其中酶的活性。結(jié)果表明山蕗菜根的蛋白質(zhì)很容易被自身的酶作用,其次分別為多糖,說(shuō)明山蕗菜根蛋白酶活和多糖酶活性較高。據(jù)種植山蕗菜職工反映,山蕗菜收采后留在地里的根水泡后極易腐爛,這可能與其所含高活性的酶有關(guān)。經(jīng)研究,山蕗菜根中蛋白質(zhì)、多糖含量分別為12.3%、30.4%,高活性的蛋白酶和多糖酶在適宜的條件下 (溫度和水泡)極易水解蛋白質(zhì)和多糖。

本文用福林法和 DNS法[11-12]分別測(cè)得粗提液蛋白酶和多糖酶活力為 24 221.57 U/g粗蛋白和45 018.65 U/g粗蛋白。但其活性比一些酶制劑要低,方煥等[13]測(cè)得木瓜蛋白酶活力在 37℃為 31.2萬(wàn) U/g干粉,在最適溫度 80℃時(shí)為 54.6萬(wàn) U/g干粉,分別為本蛋白酶的 15倍和 23倍。這可能與酶純度有關(guān),因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)使用的是粗酶液;此外酶作用的條件如溫度、反應(yīng)物濃度、pH、金屬離子等對(duì)酶的活性也有較大影響;因此有必要開(kāi)展山蕗菜根酶的分離純化和酶作用條件的優(yōu)化。

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