姚美村,廖祎婷,袁月梅,湯 毅

(中山大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州 510006)

葛花是豆科 (Leguminasae)植物野葛 [Pueraria lobata(W illd.)Ohwi]或干葛藤 (Pueraria thom sonii Benth.)的干燥花,《神經(jīng)農(nóng)本草經(jīng)》記載葛花主要用于解酒醒脾,治傷酒發(fā)熱煩渴、不思飲食、嘔逆吐酸、吐血和腸風(fēng)下血等,是中醫(yī)中很具代表性的解酒藥物[1]。近年來(lái)研究表明葛花中的異黃酮類是解酒、保肝作用的主要有效成分[2-4],包括葛花苷(kakkalide)、尼泊爾鳶尾異黃酮 (irisolidone)、鳶尾苷 (tectoridin)、鳶尾異黃酮 (tectorigenin)、6"-O-木糖鳶尾苷 (6"-O-xylosyl-tectoridin)、金雀花異黃苷 (genistin)和染料木素 (genistein)異黃酮類等。

眾所周知,中藥若采用不同溶劑進(jìn)行提取,其化學(xué)成分將發(fā)生較大變化,對(duì)應(yīng)的有效成分也可能不同;而中藥的粗提物中往往含有較多雜質(zhì),需要采用各種純化手段富集其中的藥效物質(zhì)。為了更好的開(kāi)發(fā)葛花這一傳統(tǒng)解酒要藥,對(duì)葛花中異黃酮類成分的進(jìn)行提取、定性和定量研究確有必要。目前對(duì)于葛花提取物中總黃酮的含量測(cè)定,已有的文獻(xiàn)中多以葛根素或葛花苷為對(duì)照品,采用紫外分光光度法(UV)進(jìn)行測(cè)定。而有文獻(xiàn)報(bào)道[5]這兩種成分在葛花中的含量都非常低,我們前期的研究中已以鳶尾苷等為定量指標(biāo)進(jìn)行了分析,為了更全面分析和評(píng)價(jià)葛花的質(zhì)量,本研究將采用葛花黃酮類主要成分和總黃酮測(cè)定的方法對(duì)葛花進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

本研究將以不同濃度的乙醇回餾制備葛花提取物,并采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)其中的總黃酮進(jìn)行純化。以高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定葛花提取物及其純化物中鳶尾苷、6"-O-木糖鳶尾苷、染料木素 3種主要黃酮類成分的含量,并將 UV法測(cè)定的總異黃酮含量結(jié)果與 HPLC法所得結(jié)果進(jìn)行比較,以優(yōu)選葛花黃酮類成分的提取和純化的工藝。

1 儀器與材料

Waters高效液相色譜系統(tǒng) (含 Waters 1525泵,Waters 2487雙通道紫外檢測(cè)器,Waters 717plus自動(dòng)進(jìn)樣器,Breeze色譜工作站,美國(guó) Waters公司);Mettler Toledo AG285電子天平 (瑞士梅特勒公司);TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);SB25-12D超聲波清洗機(jī) (寧波新芝生物科技股份有限公司);電子恒溫水浴鍋 (廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠);DZF-6051型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

乙醇 (分析純,江蘇漢邦科技有限公司),甲醇、乙腈 (色譜純,美國(guó)霍尼韋爾公司),超純水;AB-8大孔吸附樹(shù)脂 (南開(kāi)大學(xué)化工廠,批號(hào):5-1);鳶尾苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,批號(hào):111632-200501),6"-O-木糖鳶尾苷 (自制,經(jīng) HPLC歸一化法測(cè)定純度為 99.1%);染料木素 (上海同田生物技術(shù)有限公司提供,批號(hào):06070613);葛花藥材 (廣州市藥材公司),經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)王軍副教授鑒定為野葛 [Pueraria lobata(W illd.)Ohwi]的干燥花。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 葛花提取物的制備

稱取葛花藥材約 10 g,精密稱定,共 4份;分別采用水和體積分?jǐn)?shù)比為 30%、50%、70%、90%的乙醇水溶液為提取溶劑制備葛花提取物:以 100 mL提取溶劑浸泡藥材 1 h后,回流提取 3次,第 2、3次分別使用 80 mL提取溶劑,每次 1 h;合并 3次濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇,真空干燥,得到棕黃到深棕色的細(xì)粉狀葛花提取物,稱重,保存。

2.2 葛花純化物的制備

稱取大孔吸附樹(shù)脂濕樹(shù)脂約 220 g,活化后濕法裝柱;稱取 1 g葛花提取物,用 20 mL純化水溶解上柱:先用純化水沖洗至基本無(wú)糖類物質(zhì)流出,再用90%乙醇沖洗至流出液基本無(wú)色。將 90%醇洗部分的乙醇蒸干,所得浸膏真空干燥,得到細(xì)粉狀提取物,稱重,保存。計(jì)算提取物折合后的純化物總重量。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鳶尾苷、6"-O-木糖鳶尾、染料木素對(duì)照品 11.82、9.3、5.0 mg,置 50 mL容量瓶中 ,以80%甲醇溶解并稀釋至刻度,制成對(duì)照品貯備液。根據(jù)測(cè)定需要精密量取對(duì)照品貯備液進(jìn)行稀釋,即得對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.4 色譜條件

采用 GRACE C18(250 mm ×4.6 mm,5μm)色譜柱 (美國(guó)格雷斯公司),流動(dòng)相:乙腈 (A)-水(B),線性梯度洗脫 (A-B:0 min 15:85;35 min 50:50;36 min 15:85;40 min 15:85;v/v);流速:0.8 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):265 nm;室溫。

2.5 HPLC法測(cè)定 3種異黃酮成分的含量

分別稱取葛花提取物 50 mg、純化物 12.5 mg,精密稱定,分別用 80%甲醇超聲溶解并定容于 50 mL容量瓶中,搖勻,微孔濾膜過(guò)濾后,取續(xù)濾液 10 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析,記錄峰面積。以外標(biāo)法計(jì)算其中鳶尾苷和 6"-O-木糖鳶尾的含量,染料木素的含量則以其峰面積相對(duì)鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的百分比進(jìn)行計(jì)算。

2.6 UV法測(cè)定葛花提取物的總黃酮含量

取濃度為 10.02μg/mL的鳶尾苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL,分置于 10 mL容量瓶中,以 80%甲醇定容,搖勻,于 265 nm測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別稱取葛花提取物、純化物50 mg,精密稱定,以 80%甲醇超聲溶解并定容于50 mL容量瓶中,搖勻,濾過(guò),稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后 (使吸光值在 0.2～0.8之間),于 265 nm測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中總黃酮的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 葛花不同溶劑的提取和純化結(jié)果見(jiàn)表1:

表1 葛花不同溶劑的提取和純化結(jié)果

結(jié)果顯示,以純水為提取溶劑時(shí)得到的粗提物最多,90%乙醇提取物最少;但經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂柱純化后,所得純化物的質(zhì)量相對(duì)提取物來(lái)說(shuō)大大減小,但總體相差不大;這一方面說(shuō)明純化物中確實(shí)減少了許多水溶性雜質(zhì),另一方面也說(shuō)明大孔樹(shù)脂的純化基本保留了絕大部分所需要的黃酮類成分,其中以50%乙醇為提取溶劑并純化時(shí)可得到最大的收率。

3.2 葛花黃酮類成分含量的測(cè)定

葛花 70%乙醇提取物的 HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。鳶尾苷和 6"-O-木糖鳶尾苷的峰面積 (Y)與濃度(X)分別在 11.8～236.4和 10.33～185.99μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;回歸方程分別為 Y=34920X-1156.5(r=0.999 8,n=7)和Y=30731X-216635(r=0.999 2,n=7);平均回收率分別為103.7%和 100.2%,RSD<2%(n=9)。不同葛花提取物與純化物中 3種主要黃酮類成分的 HPLC測(cè)定結(jié)果 (占藥材質(zhì)量百分?jǐn)?shù))見(jiàn)表2。

圖1 6"-O-木糖鳶尾苷、鳶尾苷與染料木素混合對(duì)照品

表2 不同葛花提取物及純化物的 HPLC測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明,隨著提取溶劑中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,提取物中 3種黃酮成分占總藥材的百分?jǐn)?shù)呈增加趨勢(shì),其中 50%及 70%乙醇為提取溶劑可以得到較大的收率。經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后,葛花總黃酮并無(wú)較大損失,說(shuō)明該純化方法基本保留了粗提物中的黃酮類成分。

3.3 葛花提取物經(jīng)大孔樹(shù)脂純化前后的黃酮含量見(jiàn)表3。

表3 葛花提取物經(jīng)大孔樹(shù)脂純化前后的成分比較

由表3可以看到,按歸一化法計(jì)算,所測(cè) 3種黃酮的峰面積之和達(dá)到總峰面積 80%以上,為提取物中總黃酮的主要成分。經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后,3種黃酮成分的峰面積之和百分?jǐn)?shù)均有所提升,同時(shí)提取物中總黃酮的含量顯著增大,均超過(guò)了 50%,說(shuō)明其純度得到了很大的提高。

3.4 UV法測(cè)定結(jié)果與 HPLC測(cè)定結(jié)果的比較

用UV法測(cè)定葛花總黃酮的含量,吸光度 (Y)與濃度 (X)在 1～10μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;回歸方程為 Y=0.0741X+0.001(r=0.999 8,n=5);平均回收率為 99.5%,RSD<2%(n=5)。UV法測(cè)定結(jié)果與 HPLC測(cè)定結(jié)果的比較見(jiàn)表4,測(cè)定結(jié)果以待測(cè)物占藥材質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示。

表4 UV法與 HPLC法測(cè)定葛花總黃酮含量的結(jié)果比較

由表4中 UV法與 HPLC法測(cè)得結(jié)果的差值可以看出,葛花提取物中總黃酮含量在以 30%或 50%乙醇為提取溶劑時(shí)的兩種方法結(jié)果差異較大,其余結(jié)果較為接近。經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后,兩種方法的測(cè)定結(jié)果差異減小,說(shuō)明大孔樹(shù)脂可以減少干擾總黃酮測(cè)定的雜質(zhì)的量。以純化物的總黃酮為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),UV法測(cè)定結(jié)果表明以 70%乙醇為提取溶劑時(shí)葛花黃酮的收率最高,而 HPLC法的結(jié)果則顯示以50%乙醇為提取溶劑能得到最大的黃酮收率。

從結(jié)果還可以看出,70%乙醇提取物經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后,UV法與 HPLC法測(cè)得的總黃酮含量最為一致。而以 50%乙醇回餾提取雖能得到最大的總黃酮收率,但兩種方法的分析結(jié)果差異卻很大。綜合上述兩個(gè)定量方法的測(cè)定結(jié)果,可推斷以 70%乙醇提取葛花總黃酮最為合理,在保證了較高的總黃酮收率的同時(shí),以 HPLC法或 UV法對(duì)其進(jìn)行總黃酮的含量測(cè)定也較為可靠。

4 討 論

4.1 本研究建立了葛花藥材中主要異黃酮類成分鳶尾苷、6"-O-木糖鳶尾苷與染料木素的 HPLC定量分析方法,以此法對(duì)葛花的不同濃度乙醇提取物及其大孔樹(shù)脂純化物進(jìn)行了含量測(cè)定,并將該法結(jié)果與UV法測(cè)定的總黃酮結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,不同工藝提取的葛花提取物中異黃酮類成分有較大區(qū)別,大孔吸附樹(shù)脂純化后可顯著提高總黃酮的純度;所建立的 HPLC法準(zhǔn)確、可靠,可用于葛花中 3種黃酮的含量測(cè)定;HPLC聯(lián)合UV法可共同用于葛花的質(zhì)量評(píng)價(jià)及提取工藝的研究。

4.2 HPLC分析結(jié)果顯示,所測(cè)定的 3種物質(zhì)為葛花中黃酮的主要成分,可作為葛花質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)物質(zhì)。經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后葛花提取物的黃酮純度增加,同時(shí)其藥材中黃酮的百分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果減小,說(shuō)明未經(jīng)純化前的粗提物存在造成分析結(jié)果偏大的雜質(zhì)。HPLC法與UV法對(duì)于不同的葛花提取物,其總黃酮的測(cè)定結(jié)果差異不等。HPLC測(cè)定結(jié)果顯示,50%乙醇能得到最大的黃酮收率,與相關(guān)研究中以UV為分析方法得到的結(jié)果不同[6]。但綜合兩種分析方法,以 70%乙醇為提取溶劑時(shí),不僅可以得到較高的葛花黃酮收率,其 HPLC與 UV法的測(cè)定結(jié)果差值也較小,故為提取葛花總黃酮的最佳溶劑。

4.3 國(guó)內(nèi)外以 HPLC法測(cè)定葛花中黃酮類物質(zhì)的報(bào)道并不多,且測(cè)定指標(biāo)的選擇不盡相同。國(guó)內(nèi)研究方面,張淑萍等[7]采用 HPLC法測(cè)定野葛花中葛花苷、次葛花苷及尼泊爾鳶尾異黃酮含量,張國(guó)峰等[8]則以 HPLC法同時(shí)測(cè)定了野葛花中葛花苷、尼泊爾鳶尾異黃酮、鳶尾黃素 -7-O-木糖葡萄糖苷、鷹嘴豆芽素 A的含量。而本研究結(jié)果表明,葛花乙醇提取物中主要的異黃酮類物質(zhì)為鳶尾苷、6"-O-木糖鳶尾苷和染料木素,其他成分幾乎檢測(cè)不到,這與一些相關(guān)報(bào)道一致[5,9]。究竟為何不同葛花樣品的 HPLC成分分析結(jié)果差異如此之大,還需進(jìn)一步探討。

4.4 國(guó)內(nèi)對(duì)于解酒中藥葛花的提取工藝研究報(bào)道不多,國(guó)外則未見(jiàn)報(bào)道。楊向東等[6]以 UV為檢測(cè)手段,采用正交設(shè)計(jì)法觀察了回餾提取葛花總黃酮的影響因素。朱中貴等[10]考察了超聲提取葛花總黃酮的影響因素。上述研究均以鳶尾苷或葛根素為對(duì)照品,以 UV法測(cè)定葛花提取物中總黃酮的含量。本研究以較為準(zhǔn)確、可靠的 HPLC法測(cè)定葛花提取物中 3種主要異黃酮成分,并以峰面積百分?jǐn)?shù)計(jì)算其中總黃酮含量;同時(shí)以 UV法測(cè)定提取物總黃酮,以兩種方法綜合評(píng)價(jià)最佳提取工藝,其結(jié)果更為科學(xué)合理。

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