姚美村,廖祎婷,袁月梅,湯 毅

(中山大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州 510006)

葛花是豆科 (Leguminasae)植物野葛 [Pueraria lobata(W illd.)Ohwi]或干葛藤 (Pueraria thom sonii Benth.)的干燥花,《神經(jīng)農(nóng)本草經(jīng)》記載葛花主要用于解酒醒脾,治傷酒發(fā)熱煩渴、不思飲食、嘔逆吐酸、吐血和腸風(fēng)下血等,是中醫(yī)中很具代表性的解酒藥物[1]。近年來研究表明葛花中的異黃酮類是解酒、保肝作用的主要有效成分[2-4],包括葛花苷(kakkalide)、尼泊爾鳶尾異黃酮 (irisolidone)、鳶尾苷 (tectoridin)、鳶尾異黃酮 (tectorigenin)、6"-O-木糖鳶尾苷 (6"-O-xylosyl-tectoridin)、金雀花異黃苷 (genistin)和染料木素 (genistein)異黃酮類等。

眾所周知,中藥若采用不同溶劑進(jìn)行提取,其化學(xué)成分將發(fā)生較大變化,對(duì)應(yīng)的有效成分也可能不同;而中藥的粗提物中往往含有較多雜質(zhì),需要采用各種純化手段富集其中的藥效物質(zhì)。為了更好的開發(fā)葛花這一傳統(tǒng)解酒要藥,對(duì)葛花中異黃酮類成分的進(jìn)行提取、定性和定量研究確有必要。目前對(duì)于葛花提取物中總黃酮的含量測(cè)定,已有的文獻(xiàn)中多以葛根素或葛花苷為對(duì)照品,采用紫外分光光度法(UV)進(jìn)行測(cè)定。而有文獻(xiàn)報(bào)道[5]這兩種成分在葛花中的含量都非常低,我們前期的研究中已以鳶尾苷等為定量指標(biāo)進(jìn)行了分析,為了更全面分析和評(píng)價(jià)葛花的質(zhì)量,本研究將采用葛花黃酮類主要成分和總黃酮測(cè)定的方法對(duì)葛花進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

本研究將以不同濃度的乙醇回餾制備葛花提取物,并采用大孔吸附樹脂對(duì)其中的總黃酮進(jìn)行純化。以高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定葛花提取物及其純化物中鳶尾苷、6"-O-木糖鳶尾苷、染料木素 3種主要黃酮類成分的含量,并將 UV法測(cè)定的總異黃酮含量結(jié)果與 HPLC法所得結(jié)果進(jìn)行比較,以優(yōu)選葛花黃酮類成分的提取和純化的工藝。

1 儀器與材料

Waters高效液相色譜系統(tǒng) (含 Waters 1525泵,Waters 2487雙通道紫外檢測(cè)器,Waters 717plus自動(dòng)進(jìn)樣器,Breeze色譜工作站,美國(guó) Waters公司);Mettler Toledo AG285電子天平 (瑞士梅特勒公司);TU-1810紫外可見分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);SB25-12D超聲波清洗機(jī) (寧波新芝生物科技股份有限公司);電子恒溫水浴鍋 (廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠);DZF-6051型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

乙醇 (分析純,江蘇漢邦科技有限公司),甲醇、乙腈 (色譜純,美國(guó)霍尼韋爾公司),超純水;AB-8大孔吸附樹脂 (南開大學(xué)化工廠,批號(hào):5-1);鳶尾苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,批號(hào):111632-200501),6"-O-木糖鳶尾苷 (自制,經(jīng) HPLC歸一化法測(cè)定純度為 99.1%);染料木素 (上海同田生物技術(shù)有限公司提供,批號(hào):06070613);葛花藥材 (廣州市藥材公司),經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)王軍副教授鑒定為野葛 [Pueraria lobata(W illd.)Ohwi]的干燥花。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 葛花提取物的制備

稱取葛花藥材約 10 g,精密稱定,共 4份;分別采用水和體積分?jǐn)?shù)比為 30%、50%、70%、90%的乙醇水溶液為提取溶劑制備葛花提取物:以 100 mL提取溶劑浸泡藥材 1 h后,回流提取 3次,第 2、3次分別使用 80 mL提取溶劑,每次 1 h;合并 3次濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇,真空干燥,得到棕黃到深棕色的細(xì)粉狀葛花提取物,稱重,保存。

2.2 葛花純化物的制備

稱取大孔吸附樹脂濕樹脂約 220 g,活化后濕法裝柱;稱取 1 g葛花提取物,用 20 mL純化水溶解上柱:先用純化水沖洗至基本無糖類物質(zhì)流出,再用90%乙醇沖洗至流出液基本無色。將 90%醇洗部分的乙醇蒸干,所得浸膏真空干燥,得到細(xì)粉狀提取物,稱重,保存。計(jì)算提取物折合后的純化物總重量。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鳶尾苷、6"-O-木糖鳶尾、染料木素對(duì)照品 11.82、9.3、5.0 mg,置 50 mL容量瓶中 ,以80%甲醇溶解并稀釋至刻度,制成對(duì)照品貯備液。根據(jù)測(cè)定需要精密量取對(duì)照品貯備液進(jìn)行稀釋,即得對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.4 色譜條件

采用 GRACE C18(250 mm ×4.6 mm,5μm)色譜柱 (美國(guó)格雷斯公司),流動(dòng)相:乙腈 (A)-水(B),線性梯度洗脫 (A-B:0 min 15:85;35 min 50:50;36 min 15:85;40 min 15:85;v/v);流速:0.8 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):265 nm;室溫。

2.5 HPLC法測(cè)定 3種異黃酮成分的含量

分別稱取葛花提取物 50 mg、純化物 12.5 mg,精密稱定,分別用 80%甲醇超聲溶解并定容于 50 mL容量瓶中,搖勻,微孔濾膜過濾后,取續(xù)濾液 10 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析,記錄峰面積。以外標(biāo)法計(jì)算其中鳶尾苷和 6"-O-木糖鳶尾的含量,染料木素的含量則以其峰面積相對(duì)鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的百分比進(jìn)行計(jì)算。

2.6 UV法測(cè)定葛花提取物的總黃酮含量

取濃度為 10.02μg/mL的鳶尾苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL,分置于 10 mL容量瓶中,以 80%甲醇定容,搖勻,于 265 nm測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別稱取葛花提取物、純化物50 mg,精密稱定,以 80%甲醇超聲溶解并定容于50 mL容量瓶中,搖勻,濾過,稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后 (使吸光值在 0.2～0.8之間),于 265 nm測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中總黃酮的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 葛花不同溶劑的提取和純化結(jié)果見表1:

表1 葛花不同溶劑的提取和純化結(jié)果

結(jié)果顯示,以純水為提取溶劑時(shí)得到的粗提物最多,90%乙醇提取物最少;但經(jīng)過大孔樹脂柱純化后,所得純化物的質(zhì)量相對(duì)提取物來說大大減小,但總體相差不大;這一方面說明純化物中確實(shí)減少了許多水溶性雜質(zhì),另一方面也說明大孔樹脂的純化基本保留了絕大部分所需要的黃酮類成分,其中以50%乙醇為提取溶劑并純化時(shí)可得到最大的收率。

3.2 葛花黃酮類成分含量的測(cè)定

葛花 70%乙醇提取物的 HPLC色譜圖見圖1。鳶尾苷和 6"-O-木糖鳶尾苷的峰面積 (Y)與濃度(X)分別在 11.8～236.4和 10.33～185.99μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;回歸方程分別為 Y=34920X-1156.5(r=0.999 8,n=7)和Y=30731X-216635(r=0.999 2,n=7);平均回收率分別為103.7%和 100.2%,RSD<2%(n=9)。不同葛花提取物與純化物中 3種主要黃酮類成分的 HPLC測(cè)定結(jié)果 (占藥材質(zhì)量百分?jǐn)?shù))見表2。

圖1 6"-O-木糖鳶尾苷、鳶尾苷與染料木素混合對(duì)照品

表2 不同葛花提取物及純化物的 HPLC測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明,隨著提取溶劑中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,提取物中 3種黃酮成分占總藥材的百分?jǐn)?shù)呈增加趨勢(shì),其中 50%及 70%乙醇為提取溶劑可以得到較大的收率。經(jīng)大孔樹脂純化后,葛花總黃酮并無較大損失,說明該純化方法基本保留了粗提物中的黃酮類成分。

3.3 葛花提取物經(jīng)大孔樹脂純化前后的黃酮含量見表3。

表3 葛花提取物經(jīng)大孔樹脂純化前后的成分比較

由表3可以看到,按歸一化法計(jì)算,所測(cè) 3種黃酮的峰面積之和達(dá)到總峰面積 80%以上,為提取物中總黃酮的主要成分。經(jīng)過大孔樹脂純化后,3種黃酮成分的峰面積之和百分?jǐn)?shù)均有所提升,同時(shí)提取物中總黃酮的含量顯著增大,均超過了 50%,說明其純度得到了很大的提高。

3.4 UV法測(cè)定結(jié)果與 HPLC測(cè)定結(jié)果的比較

用UV法測(cè)定葛花總黃酮的含量,吸光度 (Y)與濃度 (X)在 1～10μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;回歸方程為 Y=0.0741X+0.001(r=0.999 8,n=5);平均回收率為 99.5%,RSD<2%(n=5)。UV法測(cè)定結(jié)果與 HPLC測(cè)定結(jié)果的比較見表4,測(cè)定結(jié)果以待測(cè)物占藥材質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示。

表4 UV法與 HPLC法測(cè)定葛花總黃酮含量的結(jié)果比較

由表4中 UV法與 HPLC法測(cè)得結(jié)果的差值可以看出,葛花提取物中總黃酮含量在以 30%或 50%乙醇為提取溶劑時(shí)的兩種方法結(jié)果差異較大,其余結(jié)果較為接近。經(jīng)大孔樹脂純化后,兩種方法的測(cè)定結(jié)果差異減小,說明大孔樹脂可以減少干擾總黃酮測(cè)定的雜質(zhì)的量。以純化物的總黃酮為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),UV法測(cè)定結(jié)果表明以 70%乙醇為提取溶劑時(shí)葛花黃酮的收率最高,而 HPLC法的結(jié)果則顯示以50%乙醇為提取溶劑能得到最大的黃酮收率。

從結(jié)果還可以看出,70%乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂純化后,UV法與 HPLC法測(cè)得的總黃酮含量最為一致。而以 50%乙醇回餾提取雖能得到最大的總黃酮收率,但兩種方法的分析結(jié)果差異卻很大。綜合上述兩個(gè)定量方法的測(cè)定結(jié)果,可推斷以 70%乙醇提取葛花總黃酮最為合理,在保證了較高的總黃酮收率的同時(shí),以 HPLC法或 UV法對(duì)其進(jìn)行總黃酮的含量測(cè)定也較為可靠。

4 討 論

4.1 本研究建立了葛花藥材中主要異黃酮類成分鳶尾苷、6"-O-木糖鳶尾苷與染料木素的 HPLC定量分析方法,以此法對(duì)葛花的不同濃度乙醇提取物及其大孔樹脂純化物進(jìn)行了含量測(cè)定,并將該法結(jié)果與UV法測(cè)定的總黃酮結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,不同工藝提取的葛花提取物中異黃酮類成分有較大區(qū)別,大孔吸附樹脂純化后可顯著提高總黃酮的純度;所建立的 HPLC法準(zhǔn)確、可靠,可用于葛花中 3種黃酮的含量測(cè)定;HPLC聯(lián)合UV法可共同用于葛花的質(zhì)量評(píng)價(jià)及提取工藝的研究。

4.2 HPLC分析結(jié)果顯示,所測(cè)定的 3種物質(zhì)為葛花中黃酮的主要成分,可作為葛花質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)物質(zhì)。經(jīng)大孔樹脂純化后葛花提取物的黃酮純度增加,同時(shí)其藥材中黃酮的百分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果減小,說明未經(jīng)純化前的粗提物存在造成分析結(jié)果偏大的雜質(zhì)。HPLC法與UV法對(duì)于不同的葛花提取物,其總黃酮的測(cè)定結(jié)果差異不等。HPLC測(cè)定結(jié)果顯示,50%乙醇能得到最大的黃酮收率,與相關(guān)研究中以UV為分析方法得到的結(jié)果不同[6]。但綜合兩種分析方法,以 70%乙醇為提取溶劑時(shí),不僅可以得到較高的葛花黃酮收率,其 HPLC與 UV法的測(cè)定結(jié)果差值也較小,故為提取葛花總黃酮的最佳溶劑。

4.3 國(guó)內(nèi)外以 HPLC法測(cè)定葛花中黃酮類物質(zhì)的報(bào)道并不多,且測(cè)定指標(biāo)的選擇不盡相同。國(guó)內(nèi)研究方面,張淑萍等[7]采用 HPLC法測(cè)定野葛花中葛花苷、次葛花苷及尼泊爾鳶尾異黃酮含量,張國(guó)峰等[8]則以 HPLC法同時(shí)測(cè)定了野葛花中葛花苷、尼泊爾鳶尾異黃酮、鳶尾黃素 -7-O-木糖葡萄糖苷、鷹嘴豆芽素 A的含量。而本研究結(jié)果表明,葛花乙醇提取物中主要的異黃酮類物質(zhì)為鳶尾苷、6"-O-木糖鳶尾苷和染料木素,其他成分幾乎檢測(cè)不到,這與一些相關(guān)報(bào)道一致[5,9]。究竟為何不同葛花樣品的 HPLC成分分析結(jié)果差異如此之大,還需進(jìn)一步探討。

4.4 國(guó)內(nèi)對(duì)于解酒中藥葛花的提取工藝研究報(bào)道不多,國(guó)外則未見報(bào)道。楊向東等[6]以 UV為檢測(cè)手段,采用正交設(shè)計(jì)法觀察了回餾提取葛花總黃酮的影響因素。朱中貴等[10]考察了超聲提取葛花總黃酮的影響因素。上述研究均以鳶尾苷或葛根素為對(duì)照品,以 UV法測(cè)定葛花提取物中總黃酮的含量。本研究以較為準(zhǔn)確、可靠的 HPLC法測(cè)定葛花提取物中 3種主要異黃酮成分,并以峰面積百分?jǐn)?shù)計(jì)算其中總黃酮含量;同時(shí)以 UV法測(cè)定提取物總黃酮,以兩種方法綜合評(píng)價(jià)最佳提取工藝,其結(jié)果更為科學(xué)合理。

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