林妙端 陳建森 佘菲菲 陳 豪

(福建醫(yī)科大學病原生物學系福建省感染與腫瘤重點實驗室,福州350004)

幽門螺桿菌(Hp)感染是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍的主要病因,并與胃腺癌和胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。全世界約有50%的人患有 Hp相關(guān)性胃腸疾病,聯(lián)合應用質(zhì)子泵抑制劑和抗生素的三聯(lián)療法是目前控制 Hp感染的主要方案,但存在細菌耐藥,抗生素治療后細菌的球形變異、藥物不良反應及藥效經(jīng)濟學等問題[2]。因此,研制 Hp疫苗是預防和治療Hp感染切實有效的方法。近年有關(guān)核酸疫苗的研究倍受關(guān)注。核酸疫苗作為一種新型疫苗,能使機體對質(zhì)粒所編碼抗原產(chǎn)生強烈而持久的體液免疫應答和細胞免疫應答,具有安全,高效,成本相對較低,性質(zhì)比較穩(wěn)定等優(yōu)點[3]。

oipA(outer inflammatory protein)基因編碼前炎癥外膜蛋白,相對分子質(zhì)量為34 kD,是一種較強的Hp致病基因,特別在 Hp感染的炎癥過程中起著重要的作用。許多研究表明,OipA與活動性胃炎、消化性潰瘍、胃癌有明顯的相關(guān)性[4,5]。我們以往的研究結(jié)果表明oipA DNA重組質(zhì)粒,經(jīng)肌注途徑免疫,具有抗 Hp的免疫保護作用,但是保護率較低,僅50%[6]。本研究對oipA基因序列進行密碼子優(yōu)化,K ozak前導序列添加、CpG序列優(yōu)化,擬構(gòu)建攜帶oipA優(yōu)化基因真核表達載體的SL7207重組菌株,并研究其對C57BL/6小鼠抗 Hp感染的免疫保護作用,以獲得高效的口服疫苗。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞株及質(zhì)粒 幽門螺桿菌國際標準株J99及SS1株購自中國疾病預防控制中心傳染病研究所;大腸桿菌DH5α(Invitrogen公司);鼠傷寒沙門菌LB5000和aroA基因缺陷的減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207由本實驗室保存;胃腺癌細胞系(AGS)購自中科院上海細胞庫;真核表達載體pVAX1(Invitrogen公司)。

1.2 實驗動物 C57BL/6小鼠60只,6周齡,雌性,體重(18±2)克,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,實驗動物質(zhì)量合格證號為0056435,福建醫(yī)科大學動物實驗室SPF級小鼠飼養(yǎng)室飼養(yǎng),許可證號為SYXK(閩)2008-0001,適應性飼養(yǎng)1周后用于免疫實驗。

1.3 pVAX1-oipA重組子的構(gòu)建 從 GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取 HpJ99 oipA全長基因序列(基因號：NC 000921),應用DNAMAN分析基因和pVAX1的酶切圖譜,應用Oligo 6軟件設(shè)計引物序列,在上游引物的的5′端引入 PstⅠ酶切位點,下游引物的3′端引入XhoⅠ酶切位點,引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成 ,序列如下 ：oipA-F：5′-AAAACTGCAGATG AAAAAAGTCCTCTTACTAAC-3′;oipA-R ：5′-CCGCTCG AGTTAATGTTTGTTTTTTAAAGTTA-3′。以 提 取 的J99基因組為模板,用上述合成的引物進行PCR擴增。反應條件：94℃2分鐘;(94℃30秒,54℃45秒,72℃90秒)×30;72℃7分鐘。取25μl PCR產(chǎn)物(924 bp)電泳回收后,用PstⅠ和XhoⅠ對目的基因和載體pVAX1進行雙酶切,將目的基因和經(jīng)過CIP處理過的載體pVAX1連接后轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中,在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng),隨機挑取單克隆菌落過夜培養(yǎng),小量提取質(zhì)粒進行PCR,酶切鑒定,并將初步鑒定含陽性重組子的細菌克隆送上海博尚生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

1.4 oipA基因序列的優(yōu)化和pVAX1-optioipA重組子的構(gòu)建 在保持oipA基因全部氨基酸不變的原則下,由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司應用軟件將其密碼子改為小鼠偏愛的密碼子,進行 CpG序列優(yōu)化,并在基因的上游引入PstⅠ酶切位點以及K ozak序列,下游引入XhoⅠ酶切位點,最后將合成的oipA優(yōu)化基因(942 bp)重組入真核表達載體pVAX1,命名為pVAX1-optioipA。

1.5 重組子瞬時轉(zhuǎn)染AGS細胞 將含重組子和空質(zhì)粒的菌體大規(guī)模培養(yǎng),用Qiagen Plasmid Midi K it提取pVAX1-oipA,pVAX1-optioipA,pVAX1,調(diào)整濃度為1 mg/ml。應用含10%胎牛血清(FBS)的F12培養(yǎng)基(Sigma公司),37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)AGS細胞,至對數(shù)生長期以0.25%的胰蛋白酶消化細胞,計數(shù)并轉(zhuǎn)種入6孔板,5×105/孔,培養(yǎng)約24小時至細胞密度為90%～95%。更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基,分別取4μg質(zhì)粒按比例與LipofectamineTM2000(In-vitrogen公司)和不含 FBS的培養(yǎng)基混合,室溫孵育20分鐘后均勻加入AGS細胞培養(yǎng)孔中,5小時后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時,棄去上清液,細胞以RIPA裂解液(碧云天公司)裂解,裂解細胞溶液放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Western印跡法檢測表達蛋白免疫原性 BCA法測定三組蛋白濃度后,取裂解細胞溶液加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10分鐘后,以相同蛋白量上樣,采用12%SDS-PAGE進行電泳,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜),3%牛血清白蛋白(BSA)封閉4小時,加入兔抗oipA抗體(Abmart公司為本室制備)4℃孵育過夜,洗滌3次后加AP標記的羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物公司)室溫孵育2小時,洗滌3次后涂CDP-Star,曝光,顯影,掃描。

1.7 重組減毒鼠傷寒沙門菌核酸疫苗構(gòu)建和穩(wěn)定性檢測 挑取減毒鼠傷寒沙門菌SL7207單個菌落于LB培養(yǎng)液中振蕩(200 r/min)培養(yǎng)過夜,按1∶100接種500μl菌液于50 ml LB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至OD值至0.6～0.7,用滅菌雙蒸水洗滌1次后再用10%滅菌甘油洗滌2次(4℃,4 000 r/min,10分鐘),最后加入2 ml 10%滅菌甘油重懸菌制成SL7207感受態(tài)細胞,分裝后放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。通過氯化鈣法將重組子pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA,和空質(zhì)粒pVAX1轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門菌LB5000,提取經(jīng)過甲基化修飾的pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA,pVAX1分別加入80μl SL7207感受態(tài)細胞,冰浴5分鐘后轉(zhuǎn)移至電擊杯(1 mm)中 ,電轉(zhuǎn)化條件：2 000 V電壓,25μF電容,200Ω電阻,放電時間4～5秒。電擊后將轉(zhuǎn)化液加入1 ml LB培養(yǎng)中靜置培養(yǎng)2小時,吸取100μl培養(yǎng)液接種于LB平板(50μg/ml卡那霉素)中37℃培養(yǎng)過夜,挑取陽性克隆抽提質(zhì)粒進行鑒定,培養(yǎng)制備成疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA,和空質(zhì)粒菌SL7207/pVAX1,用滅菌的PBS調(diào)成2.5×109CFU/ml備用。將構(gòu)建好的SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA,在卡那霉素(+)和卡那霉素(-)的LB培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)傳代50次,每10代提取一次質(zhì)粒,酶切鑒定。

1.8 重組減毒鼠傷寒沙門菌核酸疫苗的免疫保護作用

1.8.1 口服免疫小鼠 小鼠隨機分成5組：①PBS組(10只);②SL7207組(10只);③SL7207/pVAX1組(10只);④SL7207/pVAX1-oipA疫苗組(15只);⑤SL7207/pVAX1-optioipA疫苗組(15只)。小鼠禁食一夜,禁水4小時,先以無菌3%NaHCO3100μl灌胃以中和胃酸,30分鐘后再予 200μl菌液(5×108CFU/只)灌胃,PBS對照組予200μl PBS,2小時后恢復飲食、飲水。2周后加強免疫一次。

1.8.2 間接ELISA法測小鼠血清中抗 HpoipA特異性抗體 末次免疫2周后從小鼠眼內(nèi)眥采血制備血清。以終濃度為5μg/ml的oipA抗體(Abmart公司為本室合成)包被96孔酶標板,100μl/孔,4℃過夜,PBS(含3%BSA)37℃封閉2小時,以含 0.05%Tween 20的PBS緩沖液(PBST)洗滌后加待測血清(1∶100),每份標本均測3個復孔,37℃孵育2小時,洗滌后加HRP標記羊抗鼠IgG(美國Santa Cruz公司1∶500),37°C孵育2小時,洗滌后于各反應孔中加入臨時配制TMB底物反應液,室溫放置30分鐘顯色,加入反應終止液(2 mmol/L H2SO4),于OD490nm波長測定各反應孔OD值,以oipA抗體為陽性對照,3%BSA/PBST孔做陰性對照調(diào)零。血清抗 HpoipA IgG抗體濃度以O(shè)D490表示。

1.8.3 Hp攻擊免疫小鼠后胃組織細菌學檢測 末次免疫4周后,以 HpSS1株菌液(5×108CFU/只)灌胃攻擊,隔天1次,共3次。末次攻擊4周后,禁食24小時,處死小鼠,無菌取胃,沿胃大彎剪開,用生理鹽水漂洗后,取一小塊胃粘膜行快速尿素酶試驗,另取胃組織采用半定量細菌培養(yǎng)法,胃組織稱重后,制成勻漿 ,用布氏肉湯 1∶10、1∶100、1∶1 000 倍比稀釋后,各取100μl涂于布氏血瓊脂平板上,37℃微需氧條件下(5%O2、10%CO2、85%N2)培養(yǎng) 3～5 天 ,細菌作快速尿素酶(三強生物化工有限公司)試驗,涂片革蘭氏染色鏡檢及PCR鑒定(用上述oipA引物)。鑒定正確后進行菌落計數(shù),計算單位胃組織的定植細菌密度。

1.9 統(tǒng)計學處理 各組間率的比較用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行Fisher精確檢驗,計量資料以±s表示,各組之間進行One Way Anova檢驗,以P＜0.05和P＜0.01提示差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果

2.1 真核表達載體的構(gòu)建及鑒定 以 pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA為模板利用上述引物PCR擴增出大約為1 kb的片段(圖1);應用 PstⅠ/Xho Ⅰ分別酶切pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA,經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳顯示雙酶切后,可見釋放目標片段,目標片段約1 kb(圖2);pVAX1-oipA序列測定(上海博尚生物技術(shù)有限公司)結(jié)果顯示其核酸序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫公布的 HpJ99 oipA全長基因序列完全一致,pVAX1-optioipA序列測定(上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司)與本研究原先設(shè)計的核酸序列完全一致,證明已成功構(gòu)建了pVAX1-oipA,pVAX1-optioipA重組子。

2.2 目的基因在AGS細胞中表達的檢測 Western印跡法結(jié)果顯示：在 pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA、pVAX1瞬時轉(zhuǎn)染AGS細胞48小時后,細胞裂解液能檢測到OipA蛋白(34 kD)的表達。而空載體pVAX1未見目的蛋白條帶。與pVAX1-oipA相比,pVAX1-optioipA蛋白表達量較高(圖3),這證明經(jīng)過密碼子優(yōu)化,K ozak前導序列添加等優(yōu)化措施可以提高OipA蛋白在真核細胞中的表達量。

圖1 重組質(zhì)粒pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA PCR鑒定Fig.1 Identification of pVAX1-oipA、pVAX1-optioip A recombinant plasmid by PCR

圖2 重組質(zhì)粒pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA的酶切鑒定Fig.2 Identification of pVAX1-oipA,pVAX1-optioip A recombinant plasmid by digestion with restriction enzymes PstⅠand XhoⅠ

圖3 pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA表達OipA蛋白的 Western印跡圖Fig.3 Western blot analysis of OipA protein expressed by pVAX1-oipA,pVAX1-optiopA

圖4 重組減毒鼠傷寒沙門菌核酶疫苗的酶切鑒定Fig.4 Identification of Attenuated Salmonella typhimurium containing recombinant plasmid by digestion with restriction enzymes PstⅠand XhoⅠ

2.3 重組減毒鼠傷寒沙門菌核酸疫苗構(gòu)建和鑒定重組疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA、SL7207/pVAX1-

optioipA和空質(zhì)粒菌SL7207/pVAX1抽提質(zhì)粒,經(jīng)電泳后均獲得相應的電泳條帶,重組疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA抽提質(zhì)粒經(jīng)PstⅠ/XhoⅠ酶切后獲得一條約1 kb的電泳條帶,其大小與oipA全長序列相符(圖4),重組疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA血清凝集試驗結(jié)果均為A-F多價、O4菌體和H1鞭毛抗原陽性。證明成功構(gòu)建攜帶Hp oipA基因和oipA優(yōu)化后基因真核表達載體的SL7207重組菌株。將構(gòu)建好的SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA,在卡那霉素(+)和卡那霉素(-)的LB培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)傳代50次,每10代提取一次質(zhì)粒,酶切鑒定結(jié)果都能獲得一條約1 kb的電泳條帶,其大小與oipA全長序列相符,證明在沒有抗生素選擇壓力下重組減毒沙門氏菌能保持其穩(wěn)定性。

表1 小鼠血清抗 HpoipA特異性抗體ELISA檢測結(jié)果Tab.1 The result of ELISA detected the mice serum anti-Hp oipA antibodies

表2 小鼠胃組織細菌學檢測結(jié)果Tab.2 The result of bacteriology test of gastric mucosa

2.4 間接ELISA法測小鼠血清中抗 HpoipA特異性抗體結(jié)果 口服免疫2周后,小鼠血清抗 HpoipA特異性抗體 ELISA檢測結(jié)果見表1,疫苗接種組(SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA)小鼠血清中抗oipA抗體的OD值顯著高于對照組(P＜0.01),表明了oipA在體內(nèi)表達了相應的蛋白,該蛋白具有刺激機體產(chǎn)生免疫應答的免疫原性。其中SL7207/pVAX1-optioipA疫苗組小鼠血清中抗oipA抗體的OD值顯著高于SL7207/pVAX1-oipA疫苗組(P＜0.01),推測經(jīng)過優(yōu)化的oipA基因其蛋白在小鼠體內(nèi)得到較高水平的表達。

2.5 免疫保護實驗結(jié)果 Hp感染的科研診斷標準是:Hp培陽性或Hp形態(tài)學、尿素酶依賴試驗、血清學試驗、特異性PCR,4項中任2項陽性,即可判定為 Hp感染陽性。本實驗采用小鼠胃粘膜組織快速尿素酶試驗及細菌定量培養(yǎng)來檢測 Hp感染狀況,結(jié)果見表 2。疫苗接種組(SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA)的Hp感染率顯著低于對照組(P＜0.01)。其中SL7207/pVAX1-oipA疫苗組的Hp感染率為60%,SL7207/pVAX1-optioipA疫苗組的Hp感染率為26.67%,對感染陽性的小鼠,我們進行了 Hp定植密度的分析,發(fā)現(xiàn)3組對照組 Hp的定植密度都在105CFU/g以上,明顯高于疫苗接種組(P＜0.01),其中 SL7207/pVAX1-oipA疫苗組 Hp定植密度高于 SL7207/pVAX1-optioipA疫苗組(P＜0.01),表明oipA核酸疫苗對 Hp感染小鼠具有一定的免疫保護作用,優(yōu)化oipA基因有助于提高免疫保護的效果。

3 討論

核酸疫苗是繼減毒、滅活和亞單位疫苗之后的第3代疫苗,被譽為預防醫(yī)學領(lǐng)域的第3次疫苗革命。與以往的減毒、滅活等蛋白疫苗相比,核酸疫苗雖然具有無法比擬的優(yōu)點,但仍需優(yōu)化。針對目前的技術(shù)水平來說,沒有修飾的裸露DNA質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染細胞后蛋白的表達不夠理想,誘導的免疫反應較弱,因此為了得到更理想的免疫效果,進行核酸疫苗的優(yōu)化是十分必要的[3]。

核酸疫苗主要由保護性抗原及真核表達載體構(gòu)成,保護性抗原的篩選是構(gòu)建核酸疫苗的關(guān)鍵,我們實驗室以往的研究結(jié)果表明編碼OipA蛋白的核酸疫苗肌注BALB/c小鼠具有抗 Hp的免疫保護作用,但是保護效率比較低[6]。究其原因,可能與機體細胞吸收核酸疫苗的效率很低,抗原表達量少,難以達到足夠的免疫刺激劑量有關(guān)。對于疫苗而言,抗原蛋白的表達水平對其免疫原性起著十分關(guān)鍵的作用[7]。而提高核酸疫苗在機體中抗原的表達,其中重要的環(huán)節(jié)之一是通過抗原密碼子優(yōu)化。細菌、植物、動物各有自己偏好的密碼子,對已知氨基酸序列的抗原來說,可以通過優(yōu)化密碼子,使用宿主偏好的密碼子,從而提高抗原在宿主中的表達水平。有相當多的文獻報道,抗原基因密碼子的優(yōu)化可以顯著的改善蛋白的表達效率[8,9]。另一環(huán)節(jié)可以通過K ozak前導序列添加來提高抗原表達量。K ozak序列是 K ozak M發(fā)現(xiàn)的,他詳細研究了起始密碼子ATG周邊堿基定點突變后對轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響,并總結(jié)出在真核生物中,起始密碼子周邊序列為CCACCATGG時轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高,該序列被廣泛應用于真核表達載體的構(gòu)建中。謝慶軍等[10]在人p53腫瘤抑制基因編碼區(qū)前設(shè)計了一個K ozak序列,從而在蛋白翻譯水平提高基因的表達量。

近年來研究證實減毒鼠傷寒沙門菌是良好的重組質(zhì)粒承載系統(tǒng),作為疫苗載體接種安全無毒,效果優(yōu)于直接接種抗原蛋白或重組質(zhì)粒,且無需其他粘膜免疫佐劑(佐劑均有一定不良反應),具有廣闊的應用前景[11]。隨著對沙門菌毒力遺傳以及重組DNA技術(shù)的深入了解,已經(jīng)研制出許多遺傳確定的新型弱毒傷寒株作為口服活疫苗的候選菌株,其中研究最廣泛的是營養(yǎng)缺陷型弱毒株如aro基因缺失株,cya/crp基因缺失株,Dam和phoP/phoQ基因缺失株等[12]。本研究采用aroA基因缺陷的減毒鼠沙門菌SL7207為載體,aroA編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶,該酶催化2,4-二羥基苯甲酸鹽的分支酸途徑的中間反應,產(chǎn)生芳香族氨基酸。而哺乳動物不具備該合成途徑,故細菌從宿主體內(nèi)獲得這些化合物的可能性極小,使得aroA突變株在體外培養(yǎng)時依賴上述化合物生長,但在宿主體內(nèi)只能有限生長繁殖從而得到減毒。國內(nèi)外學者廣泛選用減毒鼠沙門菌SL7207作為核酸疫苗的載體菌[13-15]。

為了提高oipA核酸疫苗抗 Hp的免疫保護作用,研制高效的 Hp疫苗,本研究對oipA基因進行了一系列優(yōu)化,包括添加了 GCCACC前導序列,選擇小鼠偏愛的密碼子,并合理調(diào)整CG的含量達到CpG序列優(yōu)化,以期通過提高抗原在宿主中的表達水平,同時發(fā)揮CpG免疫佐劑的作用,提高宿主對oipA核酸疫苗的免疫應答進而提高oipA核酸疫苗抗 Hp的免疫保護作用。本實驗將oipA基因和oipA優(yōu)化基因克隆入 pVAX1真核表達載體,獲得重組子pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA。因為人類、嚙齒類以及豬這3種哺乳動物對絕大多數(shù)密碼子的偏嗜性是相同或相似[16],所以采用人胃腺癌AGS細胞對重組子的表達進行體外檢測。將上述重組子與空載體pVAX1一起瞬時轉(zhuǎn)染人胃腺癌AGS細胞,應用Western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞中優(yōu)化前后OipA蛋白的表達,研究發(fā)現(xiàn)pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA均可在AGS細胞中表達,且pVAX1-optioipA蛋白表達量高于pVAX1-oipA。在驗證了重組子表達蛋白的基礎(chǔ)上,將pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA轉(zhuǎn)入減毒鼠沙門菌SL7207,經(jīng)過鑒定制成穩(wěn)定的口服核酸疫苗。最后體內(nèi)實驗表明,優(yōu)化后的oipA基因在小鼠體內(nèi)表達的蛋白量高于未優(yōu)化的oipA基因,小鼠接種疫苗菌后均獲得一定的免疫保護,Hp感染率明顯低于對照組,而 Hp感染的疫苗組小鼠胃組織中Hp定植密度顯著降低,其中優(yōu)化后oipA核酸疫苗組獲得更好的免疫保護效果。

綜上所述,本研究成功構(gòu)建了攜帶 HpoipA核酸疫苗和優(yōu)化后oipA核酸疫苗的SL7207重組菌株,體外實驗證實其可表達具有免疫原性的抗原蛋白,體內(nèi)實驗證實其對小鼠 Hp感染具有免疫保護性,優(yōu)化oipA基因可提高核酸疫苗的免疫保護效果,這為對 Hp核酸疫苗作更深入的實驗研究及其臨床應用奠定了基礎(chǔ)。

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