年四季 李 祥 黃 黎 曹新梅 周云剛 袁 青 (瀘州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,瀘州646000)

T oll樣受體(T oll-like receptors,T LRs)是白介素-1受體(IL-1R)超家族成員,是人類進(jìn)化中高度保守的分子家族,通過識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。迄今為止,在人體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了11種 T LRs。目前對(duì) T LRs研究得比較清楚的是T LR2和T LR4。而對(duì)T LR1研究較少,只報(bào)道了T LR1分布于各種免疫細(xì)胞,如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等[1]。T LR1可識(shí)別三?；?通過T LR1/2異二聚體刺激免疫應(yīng)答[2,3]。T LR1多態(tài)性可調(diào)節(jié)對(duì)脂肽的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)和對(duì)廣譜致病菌的臨床易感性[4,5]。對(duì)于T LR1是否還能識(shí)別其他病原微生物產(chǎn)物,其識(shí)別機(jī)制怎樣,信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制又是怎樣,還可能對(duì)哪些疾病起免疫預(yù)防和治療作用等還不清楚。目前,T LR2、T LR4和 T LR9等受體蛋白相繼被表達(dá),并用于受體蛋白對(duì)病原分子的識(shí)別機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究,關(guān)于T LR1受體蛋白的表達(dá),還未見報(bào)道。本研究擬擴(kuò)增T LR1胞外區(qū)cDNA,構(gòu)建含T LR1胞外區(qū)基因的pET30a(+)/T LR1重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化 E.coliBL21。并對(duì)其進(jìn)行表達(dá),表達(dá)的 T LR1蛋白可用于對(duì)病原分子的識(shí)別機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究,從而可進(jìn)一步闡明T LR1相關(guān)免疫及炎癥機(jī)制,為尋找新的疾病治療途徑與靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD公司,總RNA提取試劑、DNA Marker、凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京天根公司;MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó) Promega公司,TaKaRa LA Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物公司;原核表達(dá)載體pET30a(+)、E.coliBL21(DE3)和E.coliJM109由本實(shí)驗(yàn)室保存;Ni-NTA純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。引物合成由上海博尚生物技術(shù)有限公司完成,DNA測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 采集健康志愿者外周靜脈血,按人淋巴細(xì)胞分離液試劑盒操作說明分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。Trizol法提取 PBMC總RNA備用。在 Gene bank中查找人T LR1基因序列,結(jié)合原核表達(dá)載體pET30a(+)圖譜上的多克隆位點(diǎn)采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)T LR1胞外區(qū)基因擴(kuò)增引物,并在其中引入酶切位點(diǎn)。上游引物：5′-GTCCCATGGCTACTAGCATCTTCC ATTTT-3′;下游引物 ：5′-ATAGCGGCCGCTTAGTTGCAGG ATAATCCAG A-3′。其中上游引物5′端引入NcoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線表示),下游引物5′端引入NotⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。以提取的人 PBMC總RNA為模板,按常規(guī)方法建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA,PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 2分鐘;94℃變性30秒,52℃退火30秒,72℃延伸90秒,30個(gè)循環(huán);72℃再延伸10分鐘。1.5%TAE瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。

1.3重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 用NcoⅠ和NotⅠ分別雙酶切純化回收的目的基因片段和pET30a(+)質(zhì)粒,經(jīng)氯仿/異戊醇抽提,乙醇沉淀的方法回收酶切質(zhì)粒和目的片段DNA后,用T4 DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化感受肽大腸桿菌JM109,篩選陽(yáng)性克隆,進(jìn)行PCR鑒定及DNA序列測(cè)定。鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒用質(zhì)粒提取試劑盒純化備用。

1.4T LR1的表達(dá) 將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒和對(duì)照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21(DE3),分別于含卡那霉素的平板上挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單菌落,接種到LB(含卡那霉素)培養(yǎng)基中37℃生長(zhǎng)至OD600=0.5～0.8,加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)后,5 000 r/min離心10分鐘,去上清,收集細(xì)菌沉淀。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體用1×PBS(pH7.4)重懸后進(jìn)行超聲波破碎,離心后取上清液和沉淀于上樣緩沖液中100℃煮沸5分鐘,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,分析目的蛋白的表達(dá)。

1.5T LR1重組蛋白的純化和鑒定 pET30a(+)/T LR1重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒對(duì)照菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后,離心沉淀細(xì)菌。按照Ni-NTA純化試劑盒(Invitrogen)中變性條件純化目的蛋白。簡(jiǎn)述步驟為：加入鹽酸胍裂解液(6 mol/L鹽酸胍,20 mmol/L NaH2PO4,50 mmol/L NaCl,pH7.8)于菌體中,室溫裂解10分鐘后,再進(jìn)行超聲波裂解。裂解液8 000 r/min離心15分鐘沉淀細(xì)菌碎片,收集上清于Ni-NTA親和層析柱,分別以不同梯度pH值的尿素溶液(8 mol/L尿素,20 mmol/L磷酸鈉,500 mmol/L NaCl,pH7.8、6.0和5.0)洗滌蛋白,最后用pH 4.0尿素溶液洗脫蛋白,SDS-PAGE電泳分析純化蛋白。

1.6Western blot鑒定表達(dá)蛋白 將蛋白粗提物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,4%脫脂奶粉/PBST室溫封閉膜1小時(shí),1×PBST(含0.05%Tween 20)洗滌后,與抗His-tag單克隆抗體(1∶1 000稀釋)室溫反應(yīng)1小時(shí),1×PBST洗滌后,加入AP標(biāo)記羊抗鼠 IgG(1∶5 000稀釋)室溫反應(yīng)1小時(shí),洗滌后,NBT/BCIP顯色。

1.7ELISA鑒定表達(dá)蛋白 用純化的T LR1胞外蛋白(50μg/ml稀釋于0.1 mol/L碳酸鹽包被緩沖液中,pH9.6)4℃過夜包被酶標(biāo)板。次日PBST洗滌酶標(biāo)板3次后,用封閉液(4%脫脂牛奶溶解于1×PBST中)37℃封閉1小時(shí);洗滌后,加入封閉液稀釋的抗His-tag單克隆抗體(1∶5 000倍稀釋)37℃封閉1小時(shí);洗滌后,加入封閉液稀釋的 HRP標(biāo)記羊抗鼠單克隆抗體((1∶5 000倍稀釋)37℃封閉1小時(shí);洗滌后,加入底物溶液TMB室溫顯色15分鐘;2 mol/L H2SO4終止顯色,讀取OD450。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR擴(kuò)增T LR1胞外段基因 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,于1 700 bp處可見清晰條帶(圖1),其大小與理論值相符。

2.2重組質(zhì)粒篩選鑒定 T LR1胞外區(qū)的PCR產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ消化后,與NcoⅠ和NotⅠ酶切的pET30a+載體連接。由于克隆所使用的內(nèi)切酶為兩個(gè)不同的酶,所以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受肽大腸桿菌JM109后涂含卡那霉素的LB平板,37℃培養(yǎng)過夜,可見平板上有散在單菌落生長(zhǎng),而對(duì)照平板上未見任何菌落生長(zhǎng)。隨機(jī)挑取單菌落,過夜培養(yǎng)(約12～16小時(shí))后提取質(zhì)粒,以T LR1片段引物進(jìn)行PCR鑒定,PCR擴(kuò)增結(jié)果與目的片段大小一致(圖2),說明T LR1胞外段基因克隆已基本成功。遂取陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序,結(jié)果與Genbank公布的T LR1序列一致(GenBank登錄號(hào)：NM-003263)。證實(shí)插入序列與設(shè)計(jì)完全相符,成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET 30a(+)/T LR1胞外區(qū)基因。

2.3T LR1胞外段蛋白的表達(dá)純化 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21后的陽(yáng)性表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲破碎,離心后取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳,發(fā)現(xiàn)目的蛋白只在沉淀中出現(xiàn),表明表達(dá)的T LR1胞外段蛋白以包涵體形式存在。將表達(dá)的蛋白用Ni-NTA親和純化試劑盒中的變性條件純化后,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,純化蛋白呈單一條帶,條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符(約為68 kD),并無明顯雜帶產(chǎn)生,說明純化效果好(圖3)。

2.4T LR1胞外段蛋白的鑒定 將蛋白粗提物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn) PVDF膜,進(jìn)行 Western blot鑒定。結(jié)果顯示,PVDF膜上在68 kD大小處有一明顯條帶產(chǎn)生,與純化蛋白的大小一致,說明表達(dá)的T LR1胞外段蛋白正確(圖4)。

2.5ELISA鑒定純化的T LR1胞外段蛋白 將純化的T LR1胞外段蛋白包被酶標(biāo)板后,由于表達(dá)的T LR1胞外段蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽,所以可以用抗組氨酸單克隆抗體進(jìn)行鑒定。ELISA結(jié)果顯示：T LR1蛋白樣品OD450值與陰性對(duì)照比例大于2.0,為陽(yáng)性反應(yīng)。說明表達(dá)的T LR1胞外段蛋白正確(圖5)。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增TLR1胞外段基因Fig.1 Amplification of the extracellular domain of TLR1 by RT-PCR

圖2 PCR鑒定克隆子Fig.2 Identification of clones by PCR

圖3 SDS-PAGE鑒定純化的TLR1胞外段蛋白Fig.3 Analysis of purified TLR1 protein by SDS-PAGE

圖4 Western blot鑒定表達(dá)的TLR1胞外段蛋白Fig.4 Analysis of expressed TLR1 protein by Western blot

圖5 ELISA鑒定純化的TLR1胞外段蛋白Fig.5 Identification of purified TLR1 protein by ELISA

3 討論

T LR家族以其獨(dú)特的“模式識(shí)別”方式,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病原微生物成分的天然免疫應(yīng)答。而天然免疫的激活又可啟動(dòng)抗原特異性的獲得性免疫應(yīng)答。因此,T LR對(duì)天然免疫和獲得性免疫均有重要的調(diào)節(jié)作用。盡管T LRs的配體都是PAMP,但不同的T LRs分子對(duì)PAMP的識(shí)別譜卻不一樣。目前研究發(fā)現(xiàn),T LR2可識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖,T LR3主要識(shí)別病毒的雙鏈RNA,而在T LR家族成員中,研究最多的是T LR4對(duì)革蘭氏陰性菌脂多糖的識(shí)別。對(duì)于T LR1的研究,目前相關(guān)報(bào)道較少。本研究表達(dá)的T LR1胞外段蛋白可用于分析T LR1與病原分子的作用方式。另外,T LR受體所介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)可通過兩種途徑阻斷,一方面胞內(nèi)段基因突變或缺失,切斷細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑;另一方面在細(xì)胞外采用抗T LR單克隆抗體可阻斷對(duì)多種激活物所引起的生物學(xué)活性,提示T LR識(shí)別病原微生物及其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)可能為胞外段結(jié)構(gòu)域[6,7]。本研究通過構(gòu)建pET30a(+)/T LR1質(zhì)粒,表達(dá)的 T LR1蛋白可用于制備特異于T LR1胞外段的單克隆抗體,并用于封阻T LR1對(duì)多種激活物引起的生物學(xué)活性,從而進(jìn)一步研究T LR1與病原體或其產(chǎn)物配體相互作用的識(shí)別機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。

本研究中表達(dá)T LR1胞外段蛋白帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽,所以采用Ni-NTA親和純化系統(tǒng)對(duì)蛋白進(jìn)行純化,保證了純化蛋白的特異性。另外組氨酸標(biāo)簽還簡(jiǎn)化了表達(dá)蛋白的鑒定。在對(duì)蛋白進(jìn)行純化時(shí),用于變性條件下純化蛋白的試劑如細(xì)菌裂解液(含高濃度鹽酸胍),以及洗滌液和洗脫液里面含有高濃度的尿素,在保存過程中pH極易發(fā)生變化,所以在進(jìn)行蛋白純化前,需對(duì)試劑的pH值進(jìn)行調(diào)整,以保證純化蛋白的純度。本研究中表達(dá)的蛋白大部分以包涵體形式存在,在純化過程中采用變性條件進(jìn)行,在后續(xù)應(yīng)用時(shí)需將蛋白進(jìn)行復(fù)性。

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