童郁，邵展，許鍇，張德亭

(溫州醫(yī)學院附屬溫州市第三臨床學院、溫州市第三人民醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325000)

人乳頭瘤病毒(HPV)是一種小的DNA雙鏈病毒，可以特異性地感染人皮膚和黏膜的鱗狀上皮細胞，引起多種良、惡性病變。在HPV感染導致的疾病中，最常見的就是尖銳濕疣和宮頸癌。根據(jù)感染的致癌性與否又可分為高危亞型和低危亞型。HPV的致病性與其亞型有關(guān)，如低危亞型感染僅誘發(fā)生殖器疣樣病變，高危亞型感染是導致宮頸癌發(fā)生最主要的原因。為了解本地區(qū)女性HPV的感染情況和型別分布，我們對2008年1-12月來我院就診的2 735例的女性下生殖道標本進行了HPV基因分型檢測，報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：病例來源于本院婦產(chǎn)科門診就診、自愿接受生殖道HPV感染篩查的有性生活婦女選取2735例有宮頸炎癥或?qū)m頸糜爛等臨床指征的病例做HPV檢測。年齡16～70歲，平均年齡(35.6±10.6)歲。從年齡≤20歲開始，以10歲為一年齡段，到≥60歲，分為6個年齡組。

1.1.2 標本采集及保存方法：用窺陰器暴露宮頸拭去宮頸口黏液，將宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動宮頸刷使其順時針方向旋轉(zhuǎn)5周。慢慢取出宮頸刷將其放入標有患者編號的取樣管內(nèi)，取樣管中已加有專用細胞保存液，擰緊瓶蓋。標本在室溫保存放置不超過2 h，4 ℃保存不超過24 h， -20 ℃保存不超過3個月。樣本應避免反復凍融。

1.1.3 試劑及儀器：HPV分型基因芯片檢測系統(tǒng)；HbriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀和HPV擴增分型檢測試劑盒(凱普生物化學有限公司，上海)；PE5700基因擴增儀(PE公司，美國)；DNA提取試劑盒(達安公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理：將裝有樣本的微量離心管，以14000 r/min速度離心5 min，棄上清，保留管底沉淀物，加入50μL裂解液懸浮沉淀，100 ℃加熱10 min，以14000 r/min速度離心10 min，取上清液按DNA提取試劑盒步驟操作。

1.2.2 PCR擴增：取PCR反應管1支，在管壁上做好標記，分別加入已提取的待測樣品DNA 1μL，反應總體系25μL，每次實驗必須設(shè)置一個陰性對照及陽性對照，處理方法同標本。PCR反應條件為20℃ 10 min，95 ℃ 9 min，爾后循環(huán)40次(95 ℃，20 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3 雜交及顯色：將PCR產(chǎn)物20μL在95 ℃加熱5 min，然后冰水浴至少2 min；讓雜交儀預熱45 ℃，在雜交孔內(nèi)放好膜芯片，用1 mL雜交液預處理分子膜；將產(chǎn)物20μL加入雜交液(45 ℃)混勻。加在分子膜上溫育10 min，排泵，雜交液沖洗膜3次，設(shè)定溫度25 ℃，用0.5 mL的封阻液封閉5 min，排泵，加入0.5 mL酶標液，溫育4 min；設(shè)置溫度36 ℃，用溶液a洗膜4次，加入0.5 mL NBT/BCIP顯色液3 min，用溶液b洗膜4次，觀察結(jié)果。當對照膜條PC點出現(xiàn)BIOTIN點和IC 點藍色斑點時提示PCR、雜交、顯色等各個環(huán)節(jié)操作正常，此時結(jié)果真實有效。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染的型別分布 在2735例樣本中檢出HPV DNA陽性病例1059例，陽性檢出率為38.7%，檢出高?；蛐?HPV16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/68型)857例，陽性率為31.3%；檢出低危型(HPV6/11/42/43/44型)244例，陽性率為8.9%；檢出常見亞性（HPV53/66/cp804）177例，陽性率為6.5%。HPV各亞型檢出情況見表1。在1059例HPVDNA陽性感染者中檢出率較高的HPV高危型有HPV16型，HPV52型，HPV58型，低危型HPV6型，HPV11型。其中檢測過程中發(fā)現(xiàn)有多重型感染患者，在檢出類型中單一型感染率為22.8%（623/2735），混合型感染率為15.9%（436/2735），最多出現(xiàn)達6種型別混合感染，見表2。

表1 HPV感染的亞型分布構(gòu)成比

表2 HPV單亞型感染和多重感染病例分布

表3 2735例婦女各年齡段分布及HPV感染檢出率

2.2 HPV感染的年齡分布 各年齡段HPV感染檢出率見表3。HPV感染率在30～40歲年齡段達高峰，50歲后就明顯下降，感染人群高峰年齡出現(xiàn)晚，但下降比較快。用SPPS10.0軟件列聯(lián)表資料分析，x2=18.23，P<0.01，各年齡段HPV感染檢出率差異有顯著性。

3 討論

世界范圍內(nèi)1/5的腫瘤與感染因子有關(guān)，其中子宮頸癌與人乳頭狀瘤病毒(HPV)的關(guān)聯(lián)最為密切。大量流行病學研究已證實，發(fā)生子宮頸癌的必要條件是高危型HPV持續(xù)感染。目前，子宮頸癌的一級和二級預防正逐步向預防、檢測和控制HPV感染的方向發(fā)展。通過大規(guī)模人群中HPV感染情況的調(diào)查，可以了解以HPV檢查為基礎(chǔ)的篩查方法在中國女性子宮頸癌預防中的作用，并為HPV疫苗的研制開發(fā)提供依據(jù)。

性生活是HPV感染的常見傳播途徑，感染者通常無明顯的臨床癥狀，易被人們忽視。據(jù)調(diào)查，宮頸癌是目前婦女致死的第二大病因，而HPV高危亞型持續(xù)感染又是導致宮頸癌變的一個必不可少的因素。年齡是宮頸癌和HPV感染的相關(guān)因素。本研究顯示：HPV感染率在30～40歲年齡段達高峰，50歲后就明顯下降，感染人群高峰年齡出現(xiàn)晚，但下降比較快。30歲后5%～10%的人為高危HPV感染持續(xù)狀態(tài)，有更高的風險患上宮頸癌，從HPV感染到子宮頸癌前病變再到宮頸癌需要一段較長的時間，而子宮頸癌是感染性疾病，可以預防且治愈率高。篩查是現(xiàn)階段控制和預防子宮頸癌的主要手段，在此時間內(nèi)，只要定期進行高危型HPV的檢查，就可以有效地減少婦女死于宮頸癌的幾率。

我們利用雜交技術(shù)[1-2]檢測2735例樣本中HPV DNA，檢出陽性病例1059例，陽性率接近40%。但比紹興地區(qū)（51.54%）、寧波地區(qū)（49.4%）、武漢（64.5%）、粵東地區(qū)（48.3%）感染率都低[3-6]，但高于北京地區(qū)[7]（17.0%）。HPV DNA高危亞型檢出857例，低危亞型檢出244例；單一型感染623例，復合型感染436例。對于從表1中觀察到，HPV16，HPV52，HPV58，HPV6，HPV11共占了HPV亞型的60%以上，為高發(fā)的亞型，而且HPV52和HPV58型與HPV16型多重合感染病例。其感染亞型分布與紹興地區(qū)[6]相同，而與廣州東部地區(qū)[8]、北京地區(qū)[7]不同，說明HPV各亞型感染存在地區(qū)差異。本研究HPV16型感染率最高，與文獻[3-7]報道一致，但與廣州東部地區(qū)[8]以HPV52為主不同。下生殖道HPV感染易復發(fā)，高危HPV感染持續(xù)存在可能發(fā)展為宮頸癌，隨診十分重要。雖然HPV感染是子宮頸癌及其癌前病變最主要的因素，然而，只有部分人感染了HPV后才能發(fā)生不同程度的子宮頸病變，最終發(fā)展為子宮頸癌。其中HPV感染型別是決定不同進展方向的主要因素之一。對于子宮頸高度病變者，本研究中HPVl6是最主要的感染型別。由于HPVl6更具有逃避免疫監(jiān)測的能力，因此HPVl6被認為是引起高度病變走向惡性病變的最主要型。雖然HPV52和HPV58型的清除率被認為介于HPVl6與低危型之間[9]，值得注意的是，本次研究證明，除HPVl6型之外，HPV感染的其他主導型別為HPV52和HPV58型，合計占人群高危型感染的25%以上。在CINII以上病變中HPV52和HPV58也是除了HPVl6型之外的主導型別其感染優(yōu)勢明顯高于HPVl8型。目前，最為理想，且能從根本上預防宮頸癌的方法就是采用疫苗進行人群一級預防。現(xiàn)有的疫苗都僅僅針對HPVl6和HPV18型，這對現(xiàn)有疫苗在亞洲人群中的保護效果提出了挑戰(zhàn)。八價疫苗(包括HPVl6，HPV18，HPV58，HPV33 HPV52，HPV31，HPV35和HPV45型)概念的提出，從理論上可以預防亞洲地區(qū)86.4%的潛在感染[9]。鑒于預防型疫苗使用時必須面臨的經(jīng)濟可承受性的問題，尤其是在經(jīng)濟處于發(fā)展中的中國地區(qū)而言，八價疫苗的可行性尚有待研究。然而，HPV52和HPV58型在亞洲，包括中國地區(qū)的特殊性不可忽視，將其引入新一代疫苗在HPV感染與子宮頸癌的防治工作中具有重要意義。

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