鄒陽(yáng)，崔春，趙謀明

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

醬油主要采用大豆、豆粕、小麥、麩皮、面粉等原料，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵以及酶促和非酶促化學(xué)反應(yīng)而成，是亞洲飲食中不可缺少的調(diào)味品，目前也逐步為西方國(guó)家廣泛接受［1］。研究表明，醬油不僅起著重要的調(diào)味作用，還含有許多生理活性物質(zhì)，具有多種保健功能，其中以抗氧化、抗癌作用最引人注目，醬油的抗氧化性也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)［2－4］。

制曲是指將曲霉接種到經(jīng)過(guò)預(yù)處理的原料上，并提供適宜的條件使曲霉菌等有益微生物充分發(fā)育繁殖，大量分泌醬油釀造所需要的各種酶類。制曲是醬油生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，成曲質(zhì)量的好壞對(duì)醬油的品質(zhì)有決定性的影響。有研究報(bào)道［5］，醬油中大量的抗氧化物質(zhì)主要是在醬油固體制曲的過(guò)程中產(chǎn)生的，而液體發(fā)酵階段是抗氧化物質(zhì)從固體中逐漸釋放到液體中的過(guò)程，因而開(kāi)展對(duì)醬油制曲的氧化性的研究是十分必要的。Lin［6］等報(bào)道了大豆經(jīng)過(guò)米曲霉等發(fā)酵后其DPPH自由基清除能力、金屬鐵離子螯合能力、總酚含量都有明顯增加。除大豆外，豆粕、小麥、麩皮、面粉等也是醬油制曲的重要原料，但對(duì)這些原料混合制曲的抗氧化性評(píng)價(jià)鮮有報(bào)道。

本研究將大豆、面粉、麩皮、豆粕、小麥粉按生產(chǎn)中常見(jiàn)的配比復(fù)合發(fā)酵，并評(píng)價(jià)醬油成曲的不同酶系的活力及抗氧化性能，為高抗氧化性能的醬油的生產(chǎn)提供理論和方法的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原料

大豆、面粉、麩皮、小麥、豆粕:市售。

菌種:曲精(滬釀3.042孢子粉)，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，孢子發(fā)芽率≥80%，孢子數(shù)≥100億/g(干基)，水分≤10%。

試劑∶均為分析級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

EL3002－電子天平，UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，ZJP-A1230恒溫恒濕培養(yǎng)箱，LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，HH-8恒溫水浴鍋，WH-3微型旋渦混合儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制曲流程

醬油制作主要采用植物蛋白含量高的大豆和豆粕為蛋白原料，小麥、麩皮、玉米等作為淀粉原料。目前醬油生產(chǎn)中使用得最多的原料是大豆、豆粕、小麥、麩皮，我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油使用的配比為大豆與小麥質(zhì)量比為100∶40和100∶50，豆粕與麩皮質(zhì)量比為100∶10和60∶40。日本醬油制曲采用的原料配比一般為:m(脫脂大豆):m(小麥)為50∶50 或60∶40［7］。本文采用如表1的原料配比。

表1 原料配比質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

大豆清洗，浸泡5～6 h，以1∶1質(zhì)量比潤(rùn)水，豆粕于121℃高壓蒸煮12 min，冷卻至40℃左右，按表1比例分別與面粉、小麥粉、麩皮混合拌勻，接種醬油曲精，平鋪在各曲盤，按文獻(xiàn)［8］在恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)44h。培養(yǎng)過(guò)程中注意及時(shí)翻曲，以調(diào)節(jié)溫度和濕度，控制品溫不超過(guò)38℃。44 h后取出醬油成曲，冷藏備用。

1.3.2 福林酚法測(cè)定中性及酸性蛋白酶活力［9］

1.3.3 β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定［10］

1.3.4 淀粉酶活力測(cè)定［11］

1.3.5 提取溶劑的選擇

以索氏抽提法［12］對(duì)醬油成曲粉脫脂。稱取5份均為4.000 g的脫脂曲粉，分別加入80 mL蒸餾水、80%乙醇、80%丙酮、17%鹽水、80%甲醇，振蕩提取1 h，取出真空抽濾，所得濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，稱重用于計(jì)算提取率，再將提取物溶解定容至50 mL測(cè)定抗氧化性。

1.3.6 DPPH自由基清除能力測(cè)定［13］

將曲粉溶解，精確吸取稀釋液2 mL，與2 mL濃度2×10－4mol/L的DPPH·溶液混合均勻后避光放置30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度值(A樣品);測(cè)定2 mL樣品稀釋液加2 mL乙醇在517 nm處的吸光值A(chǔ)對(duì)照以及2 mL蒸餾水與2 mL DPPH溶液在517 nm處的吸光值A(chǔ)空白。

1.3.7 ABTS+清除能力測(cè)定

ABTS+儲(chǔ)備液制備:以去離子水將 ABTS+和K2S2O8分別溶解并混合，使其終濃度分別為7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室溫、避光條件下靜置12～16 h，該儲(chǔ)備液可穩(wěn)定3～4 d。測(cè)定時(shí)，將ABTS+儲(chǔ)備液以磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.4)稀釋，使其吸光度達(dá)到0.700±0.020(734 nm波長(zhǎng)下)，形成ABTS+測(cè)定液。吸取4.0 mL ABTS+測(cè)定液，加人40 μL Trolox或樣品稀釋液，準(zhǔn)確振蕩30 s，測(cè)定避光反應(yīng)6 min后734 nm處的吸光值。計(jì)算Trolox當(dāng)量，即 TEAC 值［14］。

1.3.8 還原能力測(cè)定

取2 mL樣品液加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.6)及2.5 mL1%鐵氰化鉀，50℃保溫20 min，再加2.5 mL10%三氯乙酸混勻，加2.5 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1%三氯化鐵，于700 nm波長(zhǎng)比色［15］。以Trolox做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算Trolox當(dāng)量。

1.3.9 總酚含量測(cè)定

精確稱取0.005 g沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，蒸餾水溶解并定容至50 mL。該標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.1 mg/mL。準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于20 mL刻度試管中，各加6 mL水，搖勻，再加2.5 mL Folin-Denis試劑，充分搖勻。3 min之后，加入1mL 20%Na2CO3溶液，補(bǔ)足至10 mL，充分混勻，75℃水浴10 min，于760 nm處測(cè)吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線［16］。取100 μL樣品液同標(biāo)準(zhǔn)曲線的做法測(cè)定總酚含量，以100 μL蒸餾水代替樣品液，作為空白對(duì)照［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油成曲的中性和酸性蛋白酶活力

成曲的好壞直接影響后續(xù)發(fā)酵的進(jìn)行，醬油發(fā)酵前期主要是中性蛋白酶起作用，把原料中蛋白質(zhì)分解成多肽和氨基酸，產(chǎn)生醬油理化指標(biāo)成分全氮、氨基酸態(tài)氮。醬油發(fā)酵后期由于pH值下降，因此酸性蛋白酶起了主要的作用。有研究表明［18］，原料中蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶降解作用后產(chǎn)生的多肽類和氨基酸與還原糖作用產(chǎn)生的褐色色素類物質(zhì)具有抗氧化作用。

圖1 四種醬油成曲的蛋白酶活力

由圖1可知，中性蛋白酶活力強(qiáng)弱順序?yàn)?成曲2號(hào)＞成曲4號(hào)＞成曲1號(hào)＞成曲3號(hào);酸性蛋白酶活力也呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。2號(hào)、1號(hào)和4號(hào)都是以大豆為原料發(fā)酵而成，而3號(hào)是由豆粕發(fā)酵而成，總體來(lái)看，大豆制作的醬油成曲的中性和酸性蛋白酶活力比豆粕制作的醬油成曲高。豆粕為大小不一，形狀不規(guī)則的扁平顆粒，與小麥粉混合后空隙小，在制曲過(guò)程中通風(fēng)情況不好，影響了曲的生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)情況不如大豆的好，因此以大豆制得的成曲的蛋白酶活性高于豆粕。成曲2號(hào)的中性和酸性蛋白酶活力是最高的。從原料來(lái)看，2號(hào)采用了麩皮作為輔料。有研究表明［19］，麩皮富含淀粉和蛋白質(zhì)，多種維生素，鈣、鐵等無(wú)機(jī)物，且質(zhì)地疏松，表面積大，有利于米曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，因此添加麩皮制曲會(huì)使蛋白酶活力提高。

2.2 醬油曲的淀粉酶活力和β-葡萄糖苷酶活力

研究表明［20］，大豆異黃酮具有很好的抗氧化作用，而游離型異黃酮比糖苷型異黃酮的抗氧化作用更強(qiáng)。大豆原料中的異黃酮主要以糖苷型異黃酮形式存在，在發(fā)酵過(guò)程中微生物能夠分泌β-葡萄糖苷酶，糖苷型大豆異黃酮在β-葡萄糖苷酶的作用下部分轉(zhuǎn)化為游離型大豆異黃酮，使抗氧化作用明顯提高。淀粉酶將淀粉水解成還原糖，與氨基酸作用可以產(chǎn)生美拉德反應(yīng)生成具有良好的抗氧化活性的褐色物質(zhì)，而且淀粉酶與β-葡萄糖苷酶有利于原料中多酚物質(zhì)的釋放［21］，對(duì)醬油的抗氧化作用也起了重要作用。

溶劑的極性對(duì)成曲中的抗氧化活性物質(zhì)的提取具有重要的影響，而不同的抗氧化活性物質(zhì)對(duì)不同的抗氧化力評(píng)價(jià)方法的響應(yīng)也不同［23］，因此，明確提取溶劑對(duì)成曲中的抗氧化活性物質(zhì)的提取能力與選擇性是評(píng)價(jià)成曲抗氧化力的前提和基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用5種溶劑來(lái)提取(表3)，以確定最適合的提取溶劑。

表3 不同溶劑提取物清除DPPH和ABTS+自由基能力

表2 四種醬油成曲的淀粉酶活力和β-葡萄糖苷酶活力

由表2可知，4種醬油成曲的淀粉酶和β-葡萄糖苷酶活力的強(qiáng)弱為:成曲3號(hào)＞成曲4號(hào)＞成曲2號(hào)＞成曲1號(hào)。一般來(lái)說(shuō)，醬油曲的原料組成與大部分微生物培養(yǎng)基一樣，由碳源和氮源組成。大豆與豆粕蛋白質(zhì)含量豐富，適合作為米曲霉的氮源，而小麥粉、面粉被米曲霉分泌的淀粉酶水解，提供其生長(zhǎng)必須的碳源。在一定范圍內(nèi)，提供的碳源越多，米曲霉的生長(zhǎng)越旺盛，分泌的淀粉酶和β-葡萄糖苷酶也更多。3號(hào)與4號(hào)曲的原料比1號(hào)和2號(hào)曲的原料能夠提供更高的淀粉含量，適合米曲霉的生長(zhǎng)，因此具有更高的淀粉酶活力和β-葡萄糖苷酶活力。研究表明［22］，麩皮為曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源，可能與麩皮的組成成分有關(guān)，即麩皮中易利用的糖類含量低，不致產(chǎn)生分解代謝產(chǎn)物阻遏，而且麩皮中含有一定量的有機(jī)氮，可以滿足微生物對(duì)有機(jī)氮的生長(zhǎng)需要，因此成曲2號(hào)的淀粉酶及β-葡萄糖苷酶活力比1號(hào)高。

2.3 提取溶劑的確定

由表3可知，醬油成曲丙酮溶液提取物的抗氧化效果最好，提取物干重僅19 mg/mL，而DPPH清除率達(dá)到56.19%，TEAC值也最高達(dá)到68.81(μmol/g)，故選擇丙酮作為提取溶劑。

2.4 四種醬油成曲的抗氧化性評(píng)價(jià)

2.4.1 清除DPPH及ABTS+自由基能力

由表4可知，成曲清除DPPH的能力強(qiáng)弱為:2號(hào)＞1號(hào)＞4號(hào)＞3號(hào)。4種成曲在經(jīng)過(guò)原料發(fā)酵后其清除DPPH能力提高，清除ABTS+的能力也有明顯增加，說(shuō)明在制曲的過(guò)程中生成了新的抗氧化物質(zhì)。大豆發(fā)酵的1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)成曲其清除DPPH自由基的能力高于豆粕發(fā)酵的3號(hào)成曲。研究表明，大豆中含有異黃酮，多肽，大豆皂苷等具有抗氧化活性的生理活性物質(zhì)［24］，而豆粕是采取有機(jī)溶劑對(duì)大豆脫脂而成，而異黃酮可溶于有機(jī)溶劑中，因此在大豆加工成豆粕的過(guò)程中，大豆中的異黃酮等可能有一部分溶于有機(jī)溶劑中而流失，因此由大豆發(fā)酵的成曲的抗氧化性高于豆粕發(fā)酵的成曲。與1號(hào)成曲相比，以麩皮替換部分面粉的2號(hào)成曲的DPPH清除能力稍高，可見(jiàn)添加麩皮有利于提高清除DPPH自由基的能力，這也在相關(guān)研究中有證明［25］。

表4 四種醬油成曲及原料清除DPPH及ABTS+自由基能力

在清除ABTS自由基方面，清除ABTS+自由基能 力強(qiáng)弱為:1號(hào)＞2號(hào)＞4號(hào)＞3號(hào)。清除DPPH和ABTS+自由基能力的結(jié)果基本一致。1號(hào)、2號(hào)成曲清除ABTS+的能力較4號(hào)高，可能是因?yàn)?號(hào)、2號(hào)使用了較高的大豆與碳源比(4∶1)來(lái)發(fā)酵，而4號(hào)的大豆與小麥粉質(zhì)量比為1∶1。由此可見(jiàn)，大豆的含量對(duì)成曲的抗氧化能力起了重要作用。4號(hào)成曲的ABTS自由基清除能力較未發(fā)酵的原料提高達(dá)6倍，可能是由于4號(hào)成曲的β-葡萄糖苷酶活力較高，大豆異黃酮苷被β-葡萄糖苷酶水解成為異黃酮苷元，異黃酮苷元具有更高的抗氧化性，使得成曲的抗氧化活性增加［20］。

2.4.2 還原能力

由表5可知，成曲的還原能力的強(qiáng)弱為:1號(hào)＞2號(hào)＞4號(hào)＞3號(hào)。原料的還原能力相當(dāng)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵制曲后，成曲的還原能力有了明顯的提升，1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)成曲原料中都使用了大豆，3號(hào)成曲原料使用了豆粕，說(shuō)明大豆發(fā)酵而成的成曲的還原能力強(qiáng)于豆粕發(fā)酵而成的成曲。此外，1號(hào)和2號(hào)的大豆與小麥粉的比例分別為4∶1與4∶0.8，4號(hào)的大豆與小麥粉的比例為1∶1，也印證了提高原料大豆比例對(duì)成曲還原能力具有正向的影響。2號(hào)添加了麩皮作為輔料，其還原能力相對(duì)于1號(hào)并沒(méi)有增加，說(shuō)明添加麩皮對(duì)還原能力沒(méi)有影響。

表5 四種醬油原料及成曲的還原能力

2.4.3 總酚含量測(cè)定

圖2 四種醬油成曲及原料的總酚含量

由圖2可以看出，成曲的總酚含量與抗氧化能力順序一致，即由大豆作為氮源發(fā)酵的成曲的總酚含量高于由豆粕作為氮源發(fā)酵的成曲。此外，原料經(jīng)過(guò)發(fā)酵成為成曲后其總酚含量有明顯提高，研究表明［21］，通過(guò)制曲發(fā)酵后的大豆的總酚含量有很大提高，且淀粉酶與β-葡萄糖苷酶對(duì)總酚的提高都有作用，β-葡萄糖苷酶的作用較大。成曲1號(hào)的總酚含量相對(duì)于原料提高了3.64倍，成曲2號(hào)相對(duì)于原料提高了4倍。4號(hào)相對(duì)于原料總酚含量提高了5.5倍，在4種成曲中總酚含量提高得最多，可能是因?yàn)棣?葡萄糖苷酶活力較高，有研究表明［21］，β-葡萄糖苷酶有利于酚類物質(zhì)的釋放，使得總酚含量增加。

3 結(jié)論

(1)不同原料制作的醬油成曲的抗氧化活性有明顯差異，總體上看，以大豆為原料發(fā)酵的成曲抗氧化性比豆粕發(fā)酵的成曲的抗氧化性高。

(2)原料通過(guò)發(fā)酵制曲后，成曲相對(duì)與原料其清除DPPH自由基及ABTS+自由基的能力、還原能力、總酚含量都有數(shù)倍的提高。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，提高大豆在制曲原料中的比例，以及使用小麥粉作為米曲霉生長(zhǎng)的碳源，可以大大提高醬油成曲的抗氧化性，有利于制備抗氧化性更好的醬油。因此適當(dāng)?shù)脑吓浔葘?duì)制備抗氧化性更好的成曲也起了重要作用，后續(xù)可圍繞優(yōu)化原料配比展開(kāi)。

(2)蛋白酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶的活力與醬油成曲的抗氧化性有一定的關(guān)系，但蛋白酶與淀粉酶的酶活力與抗氧化性的具體關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

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