趙 爽, 章 群, 樂小亮, 彭 博, 許忠能, 韋桂峰, 李貴生

(暨南大學 水生生物研究所, 廣東省教育廳水體富營養(yǎng)化與赤潮防治重點實驗室, 廣東 廣州 510632)

中國近海5個黑鯛地理群體的遺傳變異

趙 爽, 章 群, 樂小亮, 彭 博, 許忠能, 韋桂峰, 李貴生

(暨南大學 水生生物研究所, 廣東省教育廳水體富營養(yǎng)化與赤潮防治重點實驗室, 廣東 廣州 510632)

為有效保護和利用黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)資源, 本研究測定了中國近海 5個群體(北方海域的營口與嶗山群體, 南方海域的閩清、大亞灣、東興群體)各 10尾黑鯛線粒體控制區(qū) 5′端 722bp序列以分析其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 42個單倍型, 56個多態(tài)位點; 群體單倍型多樣性為0.978～1.000, 群體核苷酸多樣性為 0.0067～0.0116。中性檢測和核苷酸不對稱分布分析表明, 中國近海黑鯛在晚更新世(165～41 kaBP)曾經(jīng)歷過種群的快速擴張。北方群體與南方群體之間的Fst值為0.1145(P=0.00), 表明存在中等程度的分化, 建議將中國近海黑鯛作為兩個管理單位。

黑鯛(Acanthopagrus schlegeli); 線粒體控制區(qū); 遺傳多樣性; 群體遺傳結(jié)構(gòu); 種群歷史動態(tài)

黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)隸屬鱸形目(Percoiformes),鯛科(Sparidae),棘鯛屬(Acanthopagrus), 是分布于中國、韓國和日本近海的底層魚類。黑鯛肉質(zhì)鮮美, 生長迅速, 適應能力強, 棲息于河口、海灣, 不作長距離洄游, 是重要的捕撈魚類和增養(yǎng)殖對象[1]。近年來海洋環(huán)境污染與棲息地破壞以及過度捕撈, 導致天然黑鯛資源急劇衰減, 種質(zhì)資源的保護、恢復和增殖迫在眉睫。了解種群的遺傳變異是評估資源現(xiàn)狀, 制定野生群體保護與恢復策略,實施養(yǎng)殖群體種質(zhì)遺傳改良的重要前 提[2]。目前中國黑鯛的遺傳變異研究主要見于 Jean等[3]對臺灣海峽沿岸7個天然群體, 楊慧榮等[4]對青島、廈門、海南3個天然群體及龔金波等[5]對青島、深圳、北海3個天然群體的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)的報道,尚未有全面深入分析中國近海各海域種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群歷史動態(tài)的報道。

線粒體 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)具有進化速度快、母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組等特點[6],是研究動物遺傳變異的良好遺傳標記。線粒體控制區(qū)為非編碼區(qū), 其進化速率要比線粒體蛋白質(zhì)編碼基因高 2～5倍, 非常適合分析種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)[7], 在魚類種群遺傳研究中應用廣泛[8～11]。為了更加有效地保護和利用黑鯛的種質(zhì)資源, 對中國沿海黑鯛的 5個主要分布區(qū)域(包括渤海, 黃海, 東海, 南海廣東海域及南海北部灣海域)中天然黑鯛群體線粒體控制區(qū)序列進行分析, 期望能較完整地揭示中國沿海黑鯛群體遺傳多樣性、 遺傳結(jié)構(gòu)及種群歷史動態(tài), 為黑鯛資源保護、種質(zhì)改良和開發(fā)利用提供科學依據(jù), 也為評估近年來增殖放流效果及其對黑鯛遺傳多樣性影響提供背景資料。

圖1 采樣點的分布及中國沿海海流和洋流情況(根據(jù)孫海平等[12]修改)Fig. 1 Map of the studied area depicting sampled populations and currents(modified from Sun Haiping)

1 材料與方法

1.1 材料

2004年7月～2008年11月間采自遼寧營口(渤海海域)、山東嶗山(黃海海域)、福建福清(東海海域)、廣東大亞灣(南海廣東海域)、廣西東興(南海北部灣海域)(圖1)5個地點, 每個地點各取 10尾黑鯛, 用95%的酒精處理并保存。所有樣品均為從近海作業(yè)的小型漁船上購買的野生魚類。

1.2 基因組DNA的提取與PCR擴增

取酒精保存的肌肉約 50 mg, 晾干后采用傳統(tǒng)酚-氯仿法提取總 DNA, 用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用自行設計黑鯛專一性引物CrF：5’-gttggaatcctccctactgctc-3’和 CrR：5’-tcttaacca ccctttacgccga-3’進行PCR擴增。PCR反應及測序參照陳藝燕等[13], 測序引物為CrF。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測定的序列經(jīng)人工校對后, 用 ClustalX 1.83軟件進行序列比對, MEGA4.0軟件計算核苷酸組成,堿基變異情況, 轉(zhuǎn)換和顛換值, 采用Kimura2-parameter(K2-p)模型建立單倍型鄰接樹, 采用1000次bootstrap計算分支支持率。以Arlequin 3.11軟件計算兩兩群體間Fst值, 并以1000次置換分析其統(tǒng)計學顯著性。用DNASP4.50統(tǒng)計群體單倍型多樣度(h)、核苷酸多樣度(π)。以Arlequin 3.11軟件計算Tajima’s D和Fu’s FS值, 并進行核苷酸不對稱分布分析, 并獲得τ值; 用公式τ=2ut估算種群擴張時間[14], 其中τ是擴張時間參數(shù);u=2μk,μ為變異速率,k表示序列長度;t表示自擴張以來所經(jīng)歷的代數(shù); 擴張時間T=t×代時。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征及遺傳多樣性

人工校對后獲得50尾樣品長度為722bp的線粒體控制區(qū)序列片段。其中, T、C、A、G平均含量分別為31.5%,19.9%,33.8%,14.8%, A+T含量65.3%高于G+C含量 34.7%, 表現(xiàn)出反 G偏倚; 共發(fā)現(xiàn)單倍型42個, 多態(tài)位點56個, 其中插入缺失為2個, 簡約信息位點32個, 轉(zhuǎn)換位點為7個, 沒有顛換, 轉(zhuǎn)換遠高于顛換[15]; 群體單倍型多樣性h為 0.978～1.000,群體核苷酸多樣性π為 0.0067～0.0116, 其中營口群體最低, 東興群體最高。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

以 42個單倍型構(gòu)建的鄰接樹見圖2, 單倍型H8、H9、H14為營口與嶗山群體共享, H36為福清與大亞灣群體共享, 其他單倍型為各群體特有。在K2-p模型構(gòu)建的單倍型鄰接關(guān)系樹上, 不同地理來源的單倍型較散亂無序的分布于各分枝, 沒有發(fā)現(xiàn)明顯的地理聚群; 大部分分支的 Bootstrap(1000次)支持率小于50%,沒有發(fā)現(xiàn)明顯的譜系結(jié)構(gòu)。

圖2 基于 K2-p模型建立的黑鯛控制區(qū)序列單倍型鄰接樹與單倍型在5個群體中的分布Fig. 2 NJ tree of 42 haplotypes using kimura-2 parameter model and their distributions in 5 populations of A.schlegeli

兩兩群體間Fst值見表1。中國北方海域的營口與嶗山群體之間, 南方海域的閩清、大亞灣、東興3群體兩兩之間Fst值為負值且統(tǒng)計學上沒有顯著差異(P＞0.05), 表明北方海域 2個群體之間, 南方海域的 3個群體之間都沒有明顯的遺傳分化[16];而北方海域的2個群體分別與南方海域的3個群體兩兩間Fst在 0.0567～0.14025, 且均差異顯著(P＜0.05), 表明北方海域與南方海域黑鯛間出現(xiàn)了中等程度的分化。若根據(jù)以上結(jié)果將沒有出現(xiàn)分化的地理群體合并為北方群體及南方群體, 兩者間的Fst為 0.1145 (P=0.00), 進一步說明其間存在中等程度的分化。

表1 中國近海黑鯛群體樣本數(shù)、單倍型、單倍型多樣性、核苷酸多樣性與兩兩群體間的Fst值Tab. 1 Sample size, number of mtDNA control region haplotypes, haplotype diversity, nucleotide diversity and pair-wiseFst in 5 populations of A.schlegeli in coastal waters of China

2.3 群體歷史動態(tài)

高的單倍型多樣性和低的核苷酸多樣性提示歷史上黑鯛可能經(jīng)歷過種群快速擴張[20]。將中國沿海5個黑鯛群體作為一個整體, 利用 Tajima’sD和 Fu’sFs中性檢驗以及核苷酸不對稱分布(mismatch distribution)分析種群歷史動態(tài)。Tajima’sD=-1.5468(P=0.044)和 Fu’sFs=-25.0669(P=0.000)均為負值且顯著偏離中性, 表明中國近海黑鯛可能經(jīng)歷過快速擴張[17,18]。核苷酸不配對分布呈單峰型(圖3), 與群體擴張模型下的預期分布接近, 同樣說明黑鯛種群經(jīng)歷過種群擴張[14]。根據(jù)τ的觀測值 7.979, 以5%～20%每百萬年線粒體控制區(qū)變異速率[10], 代時為 3, 可估計出黑鯛種群擴張時間在更新世晚期(約為 165～41 kaBP)。

3 討論

3.1 黑鯛的遺傳多樣性與種群歷史動態(tài)

龔金波等[5]對青島, 深圳, 北海3個黑鯛群體線粒體控制區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)群體單倍型多樣性h為0.935～0.968, 群體核苷酸多樣性π為 0.00702～0.00903, 其中北海群體最高而青海群體最低, 與本研究結(jié)果一致。與同域分布的黃鰭鯛(Acanthopagrus latus)(h：09929～0.9952,π：0.0125～0.0187)、二長棘鯛(Evynnis cardinalis)(h：0.9764～1.0000 ,π：0.0120～0.0144)[8]、白姑魚(Pennahia argentata)(h：0.9130～0.9926,π：0.0073～0.0099)[9]、 花 鱸 (Lateolabrax maculatus)(h：0.96～1,π：0.008～0.015)[11])相比較, 黑鯛具有相似的單倍型多樣性h和較低的核苷酸多樣性π。

圖3 黑鯛線粒體控制區(qū)序列核苷酸不配對分布Fig. 3 The mismatch distribution of the mitochondrial D-loop sequences of A. schlegeli

線粒體控制區(qū)為非編碼序列, 受到較小的選擇壓力, 其基因頻率主要決定于突變率及其有效群體的大小[19]。本研究檢測出黑鯛具有高的單倍型多樣性, 一方面可歸因于線粒體控制區(qū)具有高的突變率,另一方面也反映了中國沿海黑鯛具有較大的有效群體。核苷酸多樣性積累遠比單倍型多樣性積累所需的時間漫長, 黑鯛具有高的單倍型多樣性, 低的核苷酸多樣性, 推測其可能經(jīng)歷過瓶頸效應后的快速擴張[20]; 中性檢測和核苷酸不對稱分析證實了這種推測。與黑鯛類似, 研究表明中國沿海許多魚類都可能經(jīng)歷過種群擴張[10～13]。在晚更新世(126～10kaBP)期間, 地球氣候劇烈的波動導致海平面經(jīng)歷多次大幅度的下降, 在末次冰盛期一度下降130～150 m, 中國沿海大陸架曾大面積露出[21]。因此, 中國沿海一些魚類可能經(jīng)歷了冰期分布區(qū)的縮減和冰期后分布區(qū)的擴張, 這一系列事件對現(xiàn)代種群的遺傳格局產(chǎn)生重要的影響[22]。

3.2 黑鯛的遺傳結(jié)構(gòu)與管理保護

幼體隨海流的擴散是海洋魚類在較大地理范圍內(nèi)遺傳分化較小的重要原因[23]。浮性卵和幼體約20 d的浮游生活期提示黑鯛可隨中國沿岸流等海流(圖1)擴散較遠的距離[3], 因此不難解釋黑鯛北方群體之間以及南方群體之間沒有遺傳分化的發(fā)生。但黑鯛北方群體和南方群體之間出現(xiàn)顯著的遺傳分化, 表明其間可能存在某種阻止黑鯛擴散的障礙。黑鯛的繁育季節(jié)的地理變化以及中國沿岸流流向季節(jié)性變化使東海和黃海之間的幼體遷移變得困難。由于受溫度的影響, 不同海域的黑鯛群體產(chǎn)卵季節(jié)明顯不同, 如廣東為 12月～次年 3月中, 福建為 3月中～5月初, 山東為5月初～6月初[24]; 而在4～5月, 受季風影響的中國沿岸流由向南轉(zhuǎn)為向北(圖1); 因此東海以南與黃海以北的黑鯛幼體之間的相互遷移受阻。

確定進化顯著單位(Evolutionarily Significant Units,簡稱 ESUs)和管理單位(Management Units,簡稱MUs)是開展物種保護的前提。Moritz[25]認為 ESUs是指在歷史上受到長期隔離, 以致mtDNA單倍型互為單系, 核等位基因頻率具有顯著差異的群體, 注重于長期的, 進化上的管理; MUs是指在統(tǒng)計學上獨立的群體, 不管等位基因在系統(tǒng)發(fā)育上的差異如何,只要求其在核基因或 mtDNA等位基因頻率具有顯著差異即可, 適用于較短期限的管理。mtDNA控制區(qū)單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示中國近海黑鯛群體之間并沒有形成多個單系群, 因此可將中國近海黑鯛群體應視為 1個 ESUs。兩兩群體間的Fst值提示應將北方海域與南方海域的黑鯛群體作為2個MUs進行管理。

由于采樣范圍的限制, 上述研究結(jié)果不能排除未采樣地區(qū)黑鯛群體存在新的ESUs或Mus的可能。另外由于線粒體基因與核基因有著不同的進化特點,有必要進一步采取SSR, AFLP等分子標記技術(shù)分析黑鯛群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu), 為黑鯛資源的保護和開發(fā)利用提供更詳盡的信息。

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Genetic variation among 5 stocks ofAcanthopagrus schlegeliin China’s coastal waters

ZHAO Shuang, ZHANG Qun, YUE Xiao-liang, PENG Bo, XU Zhong-neng, WEI Gui-feng, LI Gui-sheng
(Institute of Hydrobiology, Jinan University, Key Laboratory for Water Eutrophication and Redtide Control,Department of Education of Guangdong Province, Guangzhou 510632, China)

Oct. ,27, 2009

Acanthopagrus schlegeli;mtDNA control region; genetic diversity; stock genetic structure; demographic history

Acanthopagrus schlegeliis an economically important marine fish endemic in East Asia, and natural resource had been reduced dramatically. To protect and exploit the valuable fish effectively, 722 bp at the 5’ of mitochondrial DNA control region of 50 individuals collected in Yingkou(YK), Laoshan(LSH), Dayawan (DYW),Dongxing(DX) were sequenced to analyze the genetic diversity and population genetic structure ofAcanthopagrus schlegeliin the coastal waters of China. Total 42 hapoltypes and 56 variable sites were detected. Genetic diversity analyses showed high levels of haplotype diversity (h：0.978～1.000) and low levels of nucleotide diversity(π：0.0067～0.0116) inA.schlegeli. The demographic history was examined by using neutrality tests and mismatch distribution analysis, which indicated a Pleistocene population expansion at about 165 000-41 000years. Climatic oscillations during the Pleistocene ice ages might have had an important impact on this species. In the Neighbor-Joining tree (NJ tree) based on Kimura 2-parameter distances, neither obvious genealogical nor geographic clusters were found. Although pair-wise comparisons ofFstindicated that there was no geographic divergence among southern FQ-DYW-DX stocks,as well as between northern YK and LSH stocks, significant geographic divergences were found between the two groups. The genetic divergences between northern and southern populations might partly be due to the different breeding seasons of different populations and seasonal changes of China coastal currents. Two Management Units (MUs) were recognized on the basis of the populations ofA.schlegeliin the coast of China.

Q173 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2010)02-0075-05

2009-10-27;

2009-12-01

國家自然科學基金資助項目(30770415); 留學歸國人員科研啟動基金資助項目(2005)

趙爽(1980-), 男, 湖南瀏陽人, 碩士, 主要從事分子生態(tài)學研究; 章群, 通信作者, 電話：020-85220239, E-mail：tqzhang@jnu.edu.cn

譚雪靜)