朱文釧 孔繁德 林祥梅 徐淑菲 吳德峰 韓雪清 吳紹強

(1.廈門出入境檢驗檢疫局 福建廈門 361012;2.福建農(nóng)林大學動物科學學院;3.中國檢驗檢疫科學研究院)

1 前言

口蹄疫 (FMD)是由口蹄疫病毒 (F MDV)引起的偶蹄動物共患的接觸性傳染病[1]。FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬,共包括 A、O、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ和亞洲Ⅰ型等 7個血清型以及 80個以上的亞型,血清型之間無交叉免疫現(xiàn)象[2]。FMD呈世界性流行,導致偶蹄動物生產(chǎn)性能下降或死亡,給畜牧業(yè)及相關產(chǎn)業(yè)如肉、奶、皮、毛等加工業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。控制和消滅口蹄疫的主要方法是接種疫苗和捕殺感染動物,但是在捕殺過程中如何檢測隱性感染動物,在接種疫苗時如何區(qū)分自然感染動物和疫苗免疫動物一直是重要問題。因此,建立一種有效的鑒別診斷方法以區(qū)別這兩類動物,檢測隱性感染已成為口蹄疫防制技術的關鍵。

動物感染 FMDV后,體內(nèi)既可以產(chǎn)生結(jié)構蛋白抗體,又可以產(chǎn)生非結(jié)構蛋白抗體,而用純化的 FMDV病毒粒子制備的滅活疫苗免疫動物后不會產(chǎn)生針對病毒的非結(jié)構蛋白的抗體,但仍會產(chǎn)生結(jié)構蛋白抗體。因此,利用傳統(tǒng) FMDV抗原包被檢測 FMDV抗體不能區(qū)分是自然感染動物還是滅活疫苗免疫動物,而利用檢測血清中非結(jié)構蛋白抗體則可以達到此目的。FMDV基因組含有一個大的開放閱讀框,編碼一個大的聚蛋白,聚蛋白逐級成熟裂解為病毒結(jié)構蛋白 (VP1、VP2、VP3、VP4)和非結(jié)構蛋白(NSP:L、2A、2B、2C、3A、3B、3ABC、3D等 )[2]。本研究采用原核表達的 FMDV 3AB非結(jié)構蛋白作為抗原進行包被,建立能夠區(qū)分自然感染動物和疫苗免疫動物的 EL ISA檢測方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑

DH5α、BL21(DE3)菌株和表達載體 PET-28(a+):由本實驗室保存;Taq DNA聚合酶、Prime STAR高保真酶、dNTP、連接酶、各種規(guī)格 Marker:購自寶生物 (大連)工程有限公司 (TAKARA);各種限制性內(nèi)切酶:購自 NEW ENGLAND Biolabs(NEB)公司;異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG):購自 Inalco公司;膠回收試劑盒:購自天根生化科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒:購自 OMEGA公司;Ni離子親和層析樹脂:購自 GE公司;咪唑:購自 Sigma-Aldrich;T MB、羊抗豬酶標二抗:購自 Sigma公司;FMDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA試劑盒:購自 PR I ONI CS公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.1.2 儀器

9700 PCR儀:AB I公司;X-22R臺式高速冷凍離心機:美國 BECK MAN公司;榮華 ZD-85A氣浴恒溫搖床:江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司;GEL-DOC-XR凝膠成像系統(tǒng):Bio-Rad公司。

2.1.3 血清

2.1.3.1 陰陽性對照血清

經(jīng) F MDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA試劑盒檢測OD值接近陽性臨界值的豬血清作為本試驗建立方法的質(zhì)控陽性血清;經(jīng)試劑盒檢測陰性的健康豬血清作為陰性對照血清。

2.1.3.2 待檢血清

本試驗室保存的豬血清。

2.2 方法

2.2.1 FMD非結(jié)構蛋白 3AB基因的合成

經(jīng) GenBank檢索分析,參照已公布的亞洲株(AY687333)選取 3AB基因,根據(jù)密碼子的簡并性和大腸桿菌的密碼子喜好性原則,在不影響氨基酸序列的前提下,修改 3AB序列中的部分稀有密碼子,將其分為 9條長引物,各長引物之間設計 12個互補序列,經(jīng)重疊 PCR法得到 3AB基因。利用P3AB5’NdeI:5’-GGAATTCCATATGATCAGCATTCCG - 3 ’和 P3AB3’SalI:5’ –ACGCGTCGACCTCAGT GACAATCAA 3’,引入酶切位點 NdeI和 SalI。

2.2.2 重組表達質(zhì)粒的構建

將合成的 3AB基因用 NdeⅠ、SalⅠ進行雙酶切,膠回收純化酶切產(chǎn)物。然后與同樣經(jīng)過 NdeⅠ、SalⅠ雙酶切、純化的表達載體 PET-28(a+)用 T4 DNA連接酶進行連接,構建重組表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài),用 PCR篩選陽性克隆,經(jīng)酶切鑒定后送天根測序,將經(jīng)測序正確的重組質(zhì)粒命名為PET-28-3AB。

2.2.3 重組質(zhì)粒的表達

將測序正確的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)感受態(tài),挑取陽性單菌落到含卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中,按 1:100接種于含 50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。當培養(yǎng)至 OD0.6～0.8時加入IPTG至終濃度為 1mmol/L,誘導表達 6h后收集菌體,取樣用 12%SDS-PAGE觀察分析結(jié)果。

2.2.4 表達蛋白的純化、復性

將誘導表達后的菌體用超聲破碎緩沖液(20mmol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA PH8.0,1mg/mL溶菌酶)按 20mL/g菌體重懸沉淀,用超聲破碎儀進行超聲破碎,分別收集超聲破碎上清和沉淀,取樣進行 SDS-PAGE分析,觀察目的蛋白表達情況。超聲沉淀經(jīng)包涵體洗滌液(20mmol/L Tris-HCl PH8.0,0.5mol/L NaCl,2mol/L Urea,2%Triton)洗滌后用包涵體變性緩沖液(20mmol/L Tris-HCl PH8.0,0.5mol/L NaCl,8mol/L Urea,100mmol/Lβ-巰基乙醇,2%Triton)重懸,4℃攪拌過夜。溶解后的包涵體用鎳離子親和層析柱進行純化,純化方法參照說明書進行。將純化洗脫的蛋白用復性緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl PH8.0,50mmol/L NaCl,1%甘油)稀釋 1倍后再用復性緩沖液至 4℃進行透析復性,每隔 6 h～8 h換液 1次,共透析 24 h,最后用超純水或用 5mmol/L Tris-HCl PH8.0透析 2次。為提高蛋白濃度可以用蔗糖或 PEG20000進行濃縮,濃縮后的蛋白用紫外分光光度計測定蛋白含量,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 表達蛋白 EL ISA檢測方法的建立

2.2.5.1 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度的確定

采用方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和陰、陽性血清最佳稀釋度。將純化的重組抗原用 pH9.6的碳酸鹽緩沖液自右向左依次倍比稀釋為 2.5 mg/L、1.25 mg/L、0.625 mg/L、0.3125 mg/L 4個濃度 ,每孔 100μL,4℃包被過夜。次日用 PBST洗滌 3遍,用 1%酪蛋白的 PBS作為封閉液,200μL/孔,37℃封閉 2 h。用稀釋液將陰、陽性血清按 1:25、1:50、1:100、1:200、1:400倍比稀釋 ,每孔 100μL,37℃孵育1 h。洗滌后加入羊抗豬酶標二抗 (1:20000)100μL,37℃孵育 1 h。常規(guī)方法加入底物、終止液,至酶標儀測定 OD450。

2.2.5.2 羊抗豬 IgG-HRP最佳工作濃度的確定

根據(jù) 2.2.5.1確定的最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度進行包被和稀釋血清,羊抗豬 IgG-HRP分別以 1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000稀釋,按常規(guī)方法進行 EL ISA操作 ,測 OD450。

2.2.5.3 封閉液的選擇

按已確立的條件,分別用含 1%酪蛋白、0.5%酪蛋白、1%BSA、0.5%BSA和 2%蔗糖的 PBS作為封閉液封閉,進行 EL ISA方法檢測,比較陽性血清和陰性血清的OD值比值 (P/N)以確定最適合的封閉液。

2.2.5.4 稀釋液的選擇

按上述已確立的條件,分別以含 0.5%酪蛋白、0.25%酪蛋白、0.5%BSA、0.25%BSA的 PBST作為稀釋液稀釋血清和二抗,按常規(guī) EL ISA方法檢測。

2.2.5.5 血清、二抗最佳作用時間的確定

按上述最佳稀釋液將參考陰、陽性血清做最佳稀釋 ,分別于 37℃作用 30 min、45 min、60 min,羊抗豬 IgG-HRP按最佳稀釋度作用 60 min固定不變,以確定最佳血清作用時間;同樣將羊抗豬 IgGHRP按最佳稀釋度稀釋,分別于 37℃作用 30 min、45 min、60 min,而固定陰、陽性血清作用時間 60 min不變,以確定最佳二抗作用時間。

2.2.5.6 最佳底物作用時間

根據(jù)上述已確立的條件,改變底物作用時間為5 min、10 min、15 min、20 min,比較各組陰、陽性血清的OD值和 P/N值,以確定最佳底物作用時間。

2.2.5.7 判定標準的確定

將已知 FMD 3AB抗體強陽性血清用已知 FMD 3AB陰性的健康仔豬血清進行系列稀釋后,用 PR ION ICS公司的 FMDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA檢測試劑盒檢測。將檢測結(jié)果OD值接近試劑盒強陽性對照和陰性對照的血清分別作為參考陽性血清和參考陰性血清,根據(jù)試劑盒判定標準,計算試劑盒陰、陽性臨界值和強陽性與弱陽性臨界值,并將接近該臨界值的血清 OD值作為參考陰、陽性臨界值和參考強陽性與弱陽性臨界值血清。用已建立的 EL ISA方法測定參考陰、陽性血清、參考陰、陽性臨界值和參考強陽性與弱陽性臨界值血清 OD值。根據(jù)血清樣品抗體效價 =(OD樣品-OD陰性)/(OD陽性-OD陰性)來確定判定標準。以參考陰、陽性臨界值血清平均 OD值作為待測樣品 OD值,根據(jù)上述公式算得的效價為陰、陽性臨界點;參考強陽性與弱陽性臨界值血清平均 OD值作為待測樣品 OD值,算得的效價為強陽性與弱陽性臨界點。

2.2.6 特異性試驗

用 FMDV疫苗免疫豬血清、豬瘟病毒 (HCV)、豬藍耳病病毒 (PRRSV)和豬細小病病毒 (PPV)陽性血清 1∶100稀釋,按已建立的 EL ISA方法進行檢測,判斷特異性。

2.2.7 重復性試驗

選取 6份豬血清,陽性、陰性血清各 3份,每份重復 5孔,用已建立的 EL ISA方法進行檢測,計算變異系數(shù)。

2.2.8 干燥方法及穩(wěn)定性試驗

選取陽性、陰性血清各 1份,每份重復 3孔,用同一批次包被的酶標板采用不同干燥方法,分別間隔 1個月、2個月、3個月進行 EL ISA檢測,根據(jù)結(jié)果判定最佳干燥方法和穩(wěn)定性。

2.2.9 符合率檢驗

對 56份豬血清分別用已建立的 EL ISA檢測方法和進口 F MDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA檢測試劑盒進行檢測,根據(jù)結(jié)果計算二者的符合率。

3 結(jié)果

3.1 3AB基因的合成

根據(jù)重疊 PCR法獲得的 3AB基因與預期長度(695bp)一致。

3.2 重組表達質(zhì)粒的構建

重組質(zhì)粒 PET-28-3AB經(jīng) NdeⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定,得到了約 670bp的 3AB片段和約 5400bp的 PET-28a(+)空載體片段。以該質(zhì)粒為模扳,擴增出約 670bp的目的片段。經(jīng)測序結(jié)果分析,核酸序列和閱讀框均正確。結(jié)果證實,重組質(zhì)粒 PET-28-3AB構建成功。

3.3 重組表達蛋白的 SDS-PAGE電泳分析

PET-28-3AB重組菌在含有卡那霉素的 LB培養(yǎng)液中培養(yǎng),待 OD值達到 0.8時,加入 1 mmol/L IPTG進行誘導表達 6 h,每隔 1 h取樣一次。表達產(chǎn)物在 SDS-PAGE結(jié)果顯示,表達的重組蛋白分子量約為 33 KD,且在誘導 6 h時蛋白的表達達到較高水平。經(jīng)超聲破碎上清液和沉淀的 SDSPAGE電泳分析,重組蛋白主要以包涵體的形式表達。包涵體經(jīng)溶解后,用 Ni離子親和層析柱進行純化,純化方法參照說明書進行。經(jīng)純化后的蛋白基本無雜帶,純度較高。蛋白復性后經(jīng)紫外分光光度計測 OD280和 OD260,根據(jù)公式 C=1.45×OD280-0.74×OD260計算其濃度為 0.25g/L。

3.4 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)的選擇

方陣法結(jié)果 (表 1)顯示:當抗原以 0.625mg/L包被,血清按 1:100稀釋時,陽性血清 OD值接近1.0,陰性 OD值較低,且 P/N=8.876較大。因此選擇 0.625mg/L作為最佳抗原包被濃度,血清最佳稀釋度為 1:100。

表 1 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度測定結(jié)果

3.5 酶標二抗最佳工作濃度的確定結(jié)果

根據(jù) 3.4確定的最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度進行包被和稀釋血清,羊抗豬 IgG-HRP分別以 1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000稀釋,結(jié)果顯示,當羊抗豬 IgG-HRP按 1:25000稀釋時,陽性血清 OD值接近 1.0,且 P/N最大,因此選擇 1:25000作為酶標二抗最佳工作濃度。

3.6 最佳封閉液和稀釋液的確定結(jié)果

按最佳抗原濃度包被,血清和二抗按照最佳稀釋倍數(shù)稀釋,用不同配方的封閉液 (包括含 1%BSA的 PBS、含 0.5%BSA的 PBS、含 1%酪蛋白的 PBS和含 0.5%酪蛋白的 PBS)和稀釋液 (包括 PBST、含0.5%酪蛋白的 PBST、含 0.25%酪蛋白的 PBST和含 0.2%BSA的 PBST)進行 EL ISA操作,結(jié)果顯示:當封閉液為含 0.5%酪蛋白的 PBS時,陽性血清 OD值接近 1.0,且 P/N值最大;當稀釋液為含 0.5%酪蛋白的 PBST時,P/N值最大。因此選擇含 0.5%酪蛋白的 PBS作為最佳封閉液,含 0.5%酪蛋白的PBST作為最佳稀釋液。

3.7 血清、二抗最佳作用時間的選擇結(jié)果

按上述已確立的條件,分別改變血清和二抗作用時間為 30 min、45 min、60 min,變化其中一個作用時間,而固定另一個作用時間為 60 min不變,用已確立的 EL ISA條件進行檢測。結(jié)果顯示,當血清作用時間為 45 min時,陽性血清 OD值接近 1.0,且 P/N值最大,因此選擇 45 min作為血清最佳作用時間;二抗作用時間為 30 min時,P/N值最大,但二抗作用時間為 30 min時,陽性血清 OD值偏小,而 45 min時,陽性血清 OD值接近且大于 1.0,P/N值也較大,因此選擇 45 min作為二抗最佳作用時間。

3.8 底物最佳顯色時間的確定

按上述已確立的 EL ISA條件,改變底物作用時間為 5 min、10 min、15 min、20 min,根據(jù)陽性、陰性血清 P/N值,確定最佳底物作用時間。結(jié)果顯示:底物作用時間為 10min時,P/N值最大,因此選擇10 min作為最佳底物作用時間。

3.9 判定標準的確定

用已建立的 EL ISA方法測定參考陰、陽性血清,參考弱陽性臨界值血清和參考強陽性與弱陽性臨界值血清 OD值,重復 11孔,取平均值。結(jié)果顯示,根據(jù)血清樣品抗體效價 =(OD樣品-OD陰性)/(OD陽性-OD陰性)來確定判定標準。根據(jù)公式計算得到樣品效價小于 0.30判為陰性,介于 0.30與0.49之間判為弱陽性,大于 0.49判為強陽性。

3.10 特異性試驗結(jié)果

按已確立的 EL ISA方法,用 FMDV疫苗免疫豬血清、HCV、PRRSV、PPV陽性血清進行交叉試驗,結(jié)果按判定標準判定均為陰性。

3.11 重復性試驗結(jié)果

用同一批重組 3AB蛋白包被的 EL ISA板對 6份樣品進行檢測,每份重復 5孔,結(jié)果顯示,重復性試驗變異系數(shù)的均值為 5.314,其中最大的為11.702,表明該方法具有良好的重復性。

3.12 干燥方法及穩(wěn)定性試驗結(jié)果

用同一批次包被的酶標板采用不同干燥方法(包括 37℃2 h、37℃4 h和真空抽干),分別間隔 1個月、2個月、3個月進行 EL ISA檢測,結(jié)果顯示,3種干燥方法中以真空抽干效果最好,隨時間延長,OD值差異較小,且 P/N值較大,說明具有較好的穩(wěn)定性。因此選擇真空干燥作為最佳干燥方法。

3.13 臨床檢驗結(jié)果

對 56份豬血清分別用已建立的 3AB-EL ISA檢測方法和 PR I ON I CS公司的 FMDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA檢測試劑盒進行檢測,結(jié)果本研究建立的EL ISA檢測結(jié)果有 3份強陽性、2份弱陽性,其余 51份為陰性,陽性率為 8.93%;PR I ON ICS公司的試劑盒檢測結(jié)果為 3份強陽性、3份弱陽性,50份陰性,陽性率為 10.71%。二者符合率為 98.21%。

4 分析與討論

(1)本研究將重組 FMDV非結(jié)構蛋白 3AB作為抗原進行包被,取代了傳統(tǒng)的滅活病毒抗原,解決了生物安全問題,能夠鑒別診斷自然感染動物和疫苗免疫動物。目前國內(nèi)外開展了大量檢測 FMDV NSP抗體方法的研究,并比較了不同非結(jié)構蛋白用于鑒別自然感染動物和疫苗免疫動物的效果。在FMDV的幾種非結(jié)構蛋白中 3D是最早用于診斷的非結(jié)構蛋白,但后來從疫苗免疫動物的體內(nèi)也檢測到 3D的抗體[3,4],說明 3D蛋白不能區(qū)分自然感染動物和疫苗免疫動物。Mezencio等[5]測定了不同來源的動物血清 2C抗體,疫苗免疫動物為陰性而自然感染動物全為陽性,但豬和牛血清中的 2C抗體消退要比 3ABC早,而且疫苗免疫牛的血清偶爾也可檢測到 2C的抗體。Bergmann等[6]比較了 3A、3B、2C、3D和 3ABC作為診斷抗原,應用間接 EL ISA試驗檢測感染牛的敏感性和準確性,以 3A、3B和3ABC為抗原檢出的結(jié)果與病毒分離和電轉(zhuǎn)移免疫印跡試驗 (Electroimmuno transfer blot,EITB)的檢出結(jié)果相一致,尤其是 3ABC效果最好。Silberstein等[7]用在大腸桿菌中表達的 3AB蛋白作檢測抗原,結(jié)果表明,3AB可以作為區(qū)別自然感染與疫苗免疫的重要指標。目前認為非結(jié)構蛋白 3AB和 3ABC抗體是鑒別 FMDV自然感染動物與疫苗免疫動物的最可靠指標[4,8]。

(2)采用 RT-PCR直接獲得的基因并不一定適合于原核系統(tǒng)的表達。為了實現(xiàn) 3AB基因在大腸桿菌中高效表達,本研究采用人工設計引物,用重疊 PCR方法合成基因。在保持 3AB基因所編碼的氨基酸序列不變的前提下,我們修改了部分稀有密碼子,使得重組的 3AB基因在大腸桿菌中獲得高效表達。

(3)本研究采用 PET-28a+作為表達載體,載體上帶有的 6×His標簽在蛋白純化時可以利用鎳離子親和層析法獲得純度較高的蛋白,這種方法是目前純化目的蛋白常用的方法,具有快速、高效的優(yōu)點。本研究采用大腸桿菌表達獲得較純的重組蛋白,但仍不可避免含有少量表達載體的抗原,而受檢動物血清中通常含有大腸桿菌抗體,會造成非特異性反應。本試驗采用 0.5%的酪蛋白作為封閉液和血清稀釋液,可有效降低本底,減少非特異性反應。國外相關研究稱可通過在樣品稀釋液中加入大腸桿菌提取物來消除非特異性反應[9]。

(4)EL ISA檢測方法的建立,其判定標準是關鍵。對于間接 EL ISA方法,其判定標準一般有兩種,一種是根據(jù)測定樣本的原始 OD值和標準差來確定臨界值;另一種是計算待測樣品的抗體效價,即待測樣品相對于陽性對照的比值,通過大量測定樣本效價及標準差來確定臨界值和可疑值。本研究在確定判定標準時是將已知 FMDV 3AB抗體陽性豬血清用已知陰性豬血清依次稀釋,用 PR I ON ICS公司的 FMDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA試劑盒進行檢測,根據(jù)試劑盒判定標準,選擇陰陽性臨界值及強陽性與弱陽性臨界值,并以此臨界值血清,用已建立的 EL ISA方法重復測定多次取平均值,計算其抗體效價,并以此作為判定標準。

(5)目前檢測口蹄疫 NS蛋白抗體的研究大多數(shù)是采用單個 NS蛋白,由于同時檢測多個 NS蛋白抗體比檢測單一蛋白抗體更能清楚地進行鑒別診斷,可以通過同時檢測血清中 1個以上的 NS蛋白抗體以提高檢測的準確性。在原核表達系統(tǒng)中,大多數(shù)NS蛋白都能以融合蛋白的形式表達,且很多情況下以包涵體形式表達,真核生物的表達系統(tǒng)與原核表達系統(tǒng)相比有其優(yōu)點,如表達蛋白的糖基化和表達產(chǎn)物不含能產(chǎn)生非特異性反應的細菌蛋白。Sorensen等[9]報道了利用桿狀病毒表達的 3ABC產(chǎn)物建立阻斷 EL ISA用于區(qū)分 FMDV自然感染動物和疫苗免疫動物具有較好的敏感性和特異性,因此可以采用真核表達系統(tǒng)消除原核表達系統(tǒng)中非特異性反應的影響。

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[6] Bergmann I E,MaliratV,Neitzert E,et al.I mprovement of a serodiagnostic strategy for Foot-and-mouth disease virus surveillance in cattle under systematic vaccination:a combined system of an indirect EL ISA-3ABC with an enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay[J].Archives of Virology,2000,145(3):473～489.

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