錢飛, 劉海英, 過世東

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

木瓜蛋白酶水解克氏原螯蝦蝦殼提取蝦青素的研究

錢飛, 劉海英, 過世東＊

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

研究以克氏原螯蝦殼為原料,利用木瓜蛋白酶對其水解提取蝦青素,通過單因素試驗和中心點實驗設(shè)計試驗優(yōu)化最佳酶解工藝條件。結(jié)果表明,酶解最適條件為:酶解溫度48.5℃、p H值5.8、酶活力為2 522U/g、水解時間63min、配液與底物固比2∶1(g∶m L),每克濕蝦殼含總類胡蘿卜素115.76μg,比用酸處理法提取量提高13.82%。高效液相檢測其蝦青素質(zhì)量濃度達到13.06 g/dL,顯著提高了萃取物中蝦青素濃度,為蝦的廢棄物的綜合利用提供了新的途徑。

蝦青素;木瓜蛋白酶;中心點實驗設(shè)計;克氏原螯蝦殼

蝦青素(astaxanthin),學(xué)名為 3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′胡蘿卜素 , 屬于葉黃族 (xanthohylls)酮式類胡蘿卜素,易溶于有機溶劑,難溶于水,具有獨特的著色、抗氧化、防癌[1-2]、促進抗體產(chǎn)生、抵御紫外線、帶維生素A活性、改善視力、免疫力、色素形成和神經(jīng)連通以及改善生育等功能[3]。蝦青素廣泛存在于自然界中,如:大多數(shù)甲殼類動物和鮭科魚類體內(nèi),植物的花中以及火烈鳥的羽毛中等,起顯色作用。絕大多數(shù)海產(chǎn)甲殼動物和魚類等自身不能合成蝦青素,而僅通過食物鏈從海洋微藻、浮游動植物獲取[4],從而在其體內(nèi)富集。文獻資料表明:Ssahindranm等[5]在印度洋海域的甲殼綱動物中,發(fā)現(xiàn)蝦青素及其酯占總類胡蘿卜素的質(zhì)量分數(shù)為65.5%～67.6%;Gladisn等[6]通過實驗證明在墨西哥彎捕獲的龍蝦中,蝦青素雙酯、單酯、游離蝦青素及葉黃素分別占總類胡蘿卜素的質(zhì)量分數(shù)為7.0%、12%、10%、8%。

目前,提取蝦青素的方法有很多,姜啟興等(2003年)[7]報道了目前國內(nèi)外從甲殼類水產(chǎn)品加工下腳料中提取蝦青素的提取方法有堿提法、油溶法、有機溶劑法、超臨界CO2萃取法。

克氏原螯蝦俗稱小龍蝦,在我國分布廣,捕撈量大,加工后的廢棄物占原料的70%～85%,是提取蝦青素的一種良好來源。但是在國內(nèi)的小龍蝦加工中,蝦殼除提取殼聚糖外,絕大多數(shù)被廢棄,造成資源浪費和環(huán)境污染,不利于其綜合利用。

本文采用木瓜蛋白酶酶解克氏原螯蝦蝦殼提取蝦青素,利用酶法脫蛋白,其化學(xué)試劑用量少,蛋白質(zhì)回收容易。同時,木瓜蛋白酶可選擇性降解甲殼素的 GIcNAc-GleN糖苷鍵,有利于蝦青素的提取[8]。利用此方法回收蝦青素,經(jīng)濟可行,污染小,對克氏原螯蝦的加工下腳料的綜合利用具有重要的意義[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

克氏原螯蝦殼(質(zhì)量分數(shù))(水分54.39%、粗蛋白 13.45%、灰分 25.88%、粗脂肪 1.93、其它4.65%),江蘇寶龍集團有限公司提供;

木瓜蛋白酶(2.0×106U/g):購于廣西南寧厐博生物工程有限公司;蝦青素標準樣品:購于sigma公司;乙腈,色譜純,其余試劑純度為分析純。

RE-85Z型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海青浦滬西儀器廠;PW 100型高速萬能粉碎機:天津市泰斯特儀器有限公司;水浴恒溫振蕩器:江蘇太倉實驗儀器廠;3K30冷凍離心機:SIGMA公司產(chǎn)品;Waters 600高效液相色譜儀:美國Waters公司產(chǎn)品;TU-1900雙波長紫外掃描儀:北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預(yù)處理 將克氏原螯蝦蝦殼洗凈,瀝干,用萬能粉碎機粉碎備用。

1.2.2 酸處理提取法 蝦殼5 g,往殼中加入2 mol/L的鹽酸20 m L,浸漬24 h后,用布氏漏斗雙層濾紙抽濾,并用水反復(fù)沖洗,除去礦物質(zhì),將沉淀物質(zhì)裝于棕色磨口瓶中,加丙酮50 mL,30℃水浴振蕩7 h,其間每隔3 h更換丙酮50 mL,合并提取液,靜置冷凍2h,快速過濾除雜將所得的有機溶劑溶液,稀釋10倍,在474 nm測吸光值,重復(fù)試驗3次。

1.2.3 酶解提取流程 蝦殼5g→加緩沖液混合→調(diào)p H→恒溫水浴振蕩木瓜蛋白酶酶解→冰水浴冷卻→布氏漏斗雙層濾紙抽濾→并反復(fù)用水沖洗(除去礦物質(zhì))→沉淀物加入丙酮25 mL→置入超聲波清洗池10 min→搖床常溫振蕩1 h→冷凍離心機在10 000 r/min,4℃下離心10 min→取上清液定容至25 m L的容量瓶中→稀釋10倍后,在474 nm,測其吸光值。

1.2.4 分光光度法測定 采用丙酮為提取劑,先稱取一定質(zhì)量的蝦青素標準樣品,溶于丙酮,配制成蝦青素標準溶液,于400～700 nm光波長范圍內(nèi)掃描最大吸收波長及吸光值。試驗結(jié)果為,蝦青素在丙酮溶液中的最大吸收波長為474 nm,標準曲線方程為:

式中:x表示蝦青素質(zhì)量濃度(μg/m L),y表示對應(yīng)的吸光度,線性回歸相關(guān)系數(shù)顯著,蝦青素質(zhì)量濃度在0～6μg/m L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。

樣品的測定:按照標準曲線繪制的操作條件測定其吸光度,從標準曲線中查出稀釋液中總類胡蘿卜素濃度?？傤惡}卜素提取量的計算公式:

式中:c為稀釋液中總類胡蘿卜素質(zhì)量濃度,單位:μg/m L;N為稀釋倍數(shù),本實驗中為10;V為定容后的體積,本實驗選取25 m L;m為蝦殼的質(zhì)量,單位:g。

1.2.5 高效液相對蝦青素檢測 標準品溶液:稱取蝦青素標品10 m g,少量二氯甲烷溶解后,用乙腈定容到100 m L容量瓶。

樣品:丙酮提取液,用50 m L石油醚萃取,40℃水浴真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2m L。

色譜條件:色譜柱為 Symm try C18(3.9×150 mm);流動相甲醇—水(90:10,V/V),體積流量0.8m L/min,柱溫為30 ℃,檢測波長480 nm,進樣量為5μm。

蝦青素的定量:蝦青素的質(zhì)量=化合物的峰面積與外標(標準品)的峰面積比×外標(標準品)濃度。

1.2.6 試驗設(shè)計 首先研究不同酶解溫度酶解T、p H、酶解時間t、酶與底物比E/S、酶解液固比對提取類胡蘿卜素量的影響。再根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,以提取類胡蘿卜素量為指標,采用中心點實驗設(shè)計,回歸分析用SAS 8.0完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸處理法提取蝦青素

利用酸處理提取蝦青素可從濕蝦殼中提取總類胡蘿卜素(101.70±2.52)μg/g。

2.2 木瓜蛋白酶酶解對總類胡蘿卜素提取量的影響

2.2.1 酶解p H對總類胡蘿卜素提取量的影響在酶與底比為2 500 U/g,50℃水浴振蕩,酶解時間為60 m in,液固比為2∶1(g∶m L)的條件下,考查酶解p H對總類胡蘿卜素提取量的影響。

圖1 酶解p H對總類胡蘿卜素提取的影響Fig.1 Effects of pH on the total carotenoidsamount

圖1顯示酶解p H對總胡蘿卜素提取的影響。當p H值小于6.0時,總類胡蘿卜素的提取量隨p H值增大而增大;當p H值小于6.0時,總類胡蘿卜素的提取量隨p H值增大而減小。說明適用于酶解克氏原蝦殼的p H值是弱酸性,在p H≈6.0時可能會有最佳點出現(xiàn)。因此選擇p H值在5.5、6.0、6.5為響應(yīng)面試驗水平。

2.2.2 酶解時間對總類胡蘿卜素提取量的影響酶與底比為2 500 U/g,50℃水浴振蕩,酶解p H=6.0,液固比為2:1的條件下,考查酶解時間對總類胡蘿卜素提取量的影響。

圖2 酶解時間對總類胡蘿卜素提取的影響Fig.2 Effect of time on the total carotenoidsamount

圖2顯示酶解時間對總類胡蘿卜素提取量的影響,在初始60 m in內(nèi),總類胡蘿卜素提取量明顯上升趨勢,水解時間超過60 min,隨著時間的增加提取量反而下降,可能是隨著時間的增加,導(dǎo)致類胡蘿卜素的破壞。因此以水解時間45、60、75 min為響應(yīng)面分析實驗水平。

2.2.3 酶與底物E/S比對總類胡蘿卜素提取量的影響 酶解時間60 min,50℃水浴振蕩,酶解p H=6.0,液固比為2∶1(g∶m L)的條件下,考查酶解時的酶與底物比對總類胡蘿卜素提取量的影響。

圖3 酶與底物比對總類胡蘿卜素提取的影響Fig.3 Effect of the ratio of enzyme to substrate on the total carotenoidsamount

圖3表明了不同酶與底物比對總類胡蘿卜素提取的影響。在酶與底物比達到2 500 U/g前,隨著酶用量的增加,水解速度加快,總類胡蘿卜素的提取量呈明顯上升趨勢。當酶活力從2 500 U/g增加到4 000 U/g時,總類胡蘿卜素的提取量上升幅度很小,曲線基本趨于平緩。因此酶活力2 250、2 500、2 750 U/g為響應(yīng)面分析實驗水平。

2.2.4 酶解溫度對總類胡蘿卜素提取的影響 酶解時間60 min,酶活力2 500 U/g,酶解p H=6.0,液固比為2∶1(g∶mL)的條件下,考查酶解溫度對總類胡蘿卜素提取量的影響。

圖4 酶解溫度對總類胡蘿卜素提取的影響Fig.4 Effect of temperature on the total carotenoidsamount

從圖4可以看出在20～50℃,總類胡蘿卜提取量隨溫度的升高而增加。50℃的總類胡蘿卜素提取量達到最高。蝦青素的提取量隨及溫度的升高先增加而后減少,這與蝦青素多雙鍵,易被氧化或斷裂的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān)。趙儀等[11]認為是由于蝦青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)是由4個異戊二烯單位以共軛雙鍵形式聯(lián)結(jié),兩端又有2個異戊二烯單位組成的六元環(huán)結(jié)構(gòu),這個長的共軛不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)決定了光、熱、氧化物很容易破壞它的結(jié)構(gòu),可見溫度對其影響十分明顯。因此,酶解溫度45、50、55℃為響應(yīng)面分析實驗水平。

圖5 不同液固比對總類胡蘿卜素提取的影響Fig.5 Effects of substance consistency on the total carotenoidsamount

2.2.5 液固比對類胡蘿卜素提取的影響 酶解時間60 min,酶活力為2 500 U/g,酶解p H=6.0,酶解溫度為50℃的條件下,考查酶解液固比對總類胡蘿卜素提取量的影響。圖5顯示不同酶與底物比對總類胡蘿卜素提取的影響,可以看出在液固比2:1(g∶mL)之前提取總類胡蘿卜素量隨著液固比的升高而升高,而在液固比為2:1后,總類胡蘿卜素量開始下降?？赡苁且汗烫?振蕩不能是酶與底物充分接觸;液固過大,導(dǎo)致底物濃度變小。為了生產(chǎn)效率的最佳,確定液固比為2:1(g∶mL)。

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

為了生產(chǎn)效率的最佳,確定液固比為2∶1,在響應(yīng)面分析中考慮其它4個因素對蝦青素提取量的影響。為找出影響蝦青素提取量的主次因素,對以上4因素進行響應(yīng)面分析實驗(見表1)。

2.3.1 數(shù)據(jù)分析 采用響應(yīng)面分析法對實驗數(shù)據(jù)進行設(shè)計,SAS軟件分析及處理數(shù)據(jù)。

依據(jù)表2的設(shè)計,應(yīng)用響應(yīng)面分析法對蝦殼酶解工藝進行優(yōu)化,得到回歸模型的顯著性檢驗及方差分析結(jié)果。將所有影響不顯著的項剔除,用SAS相應(yīng)面回歸程序,回歸擬合得到回歸方程如下:其中R2=0.893 4

表1 蝦殼酶解中心點實驗設(shè)計中變量的變化范圍和水平值Tab.1 Variance and value of analysis of focal point for experimental design

表2 蝦殼酶解工藝中心點實驗設(shè)計Tab.2 Central point for experimental design for technology for enzymatich hydrolysis

續(xù)表2

依據(jù)表2的設(shè)計,應(yīng)用響應(yīng)面分析法對酶解提取工藝優(yōu)化。得到回歸模型的各項估計值、顯著性檢驗以及方差分析結(jié)果(見表3,4)。從方差結(jié)果可看出,一次項、二次項顯著(P<0.05),將所有影響不顯著的(P>0.05)項剔除,用SAS做響應(yīng)面回歸程序,回歸擬合得到回歸方程,可看出R2達到0.8934,說明回歸模型顯著。分析表明方程中待估特征值均為負,說明指標Y(總類胡蘿卜素提取量)的穩(wěn)定值為響應(yīng)面最大值。

表3 回歸方程中各項的參數(shù)估計值Tab.3 Estimated coefficients of the fitted regression equation for different response based on t-statistic

表4 各因素對指標的方差分析Tab.4 Analysis of variance for response of dependent variables

2.4 最佳工藝條件結(jié)果驗證以及討論

在中心點實驗設(shè)計中,中心點試驗水平分別為:酶解溫度 50℃,p H值 6.0,酶活力為 2 500 U/g,水解時間60 min。經(jīng)響應(yīng)面分析,得出的最佳工藝參數(shù)以及實驗值與預(yù)測值見表5。

表5 酶解總類胡蘿卜素提取量實驗值與預(yù)測Tab.5 Comparison between predicting value and experimental value of degree of hydrolysis

由表5可知,Y(總類胡蘿卜素提取量)的理論預(yù)測最大值為117.09;試驗值為115.76,二者接近。

2.5 高效液相結(jié)果分析

圖6為蝦青素標準品的高效液相色譜圖。圖7優(yōu)化后的克氏原螯蝦殼萃取物的液相色譜圖,保留時間為5.976m in的峰為蝦青素峰。

圖6 蝦青素標品的高效液相色譜圖Fig.6 HLPC profile of astaxanthin

圖7 克氏原螯蝦蝦殼萃取物液相色譜圖Fig.7 HPLC profile of Crayfish Shell extract

結(jié)果表明,利用木瓜蛋白酶酶解并經(jīng)用有機溶劑萃取,總類胡蘿卜素中蝦青素質(zhì)量濃度達到了13.06 g/dL,其蝦青素提取率比酸溶劑法的提取率(3.37%)有顯著提高。

3 結(jié) 語

利用木瓜蛋白酶酶解處理克氏原奧蝦殼提取蝦青素,結(jié)合單因素法和中心點實驗設(shè)計計法優(yōu)化蝦青素提取的工藝條件。得到的工藝條件為:酶解溫度50.5℃,p H值5.85,水解時間63 min,酶與底物比為2 522 U/g,每克濕蝦殼含總類胡蘿卜素115.76μg;高效液相檢測其蝦青素濃度達到達到13.06 g/dL,比用酸處理提取方法的釋放率有顯著提高。本方法為蝦的廢棄物的利用提供了新的思路和方法。

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The Application of Papain in Astaxan thin Extraction from Crayfish Shell

QIAN Fei, LIU Hai-ying, GUO Shi-dong＊
(School of Food Science and Technoloqy,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The aim of this study is to develop a astaxanthin extraction process from hydrolyzing the Crayfish shell by papain.For this,the optimal hydrolyzed conditions was determined by the single factor test and the central point experimental design and the optimum conditions as fellow s:temperature 48.5,p H 5.8,E/S 2522U/g,hydrolyzed time 63 min,L/S 2:1.A higher carotenoids amount and density achieved at 115.761μg.g-1and 13.06%,respectively.The amount was higher 13.8%than that of the amount extracted by acid treatment The results presented here provided a new technology process for comprehensive utilization of shrimp waste.

astaxanthin,papain,central point for experimental design,crayfish shell

Q 814.9

A

1673-1689(2010)02-0237-07

2009-04-16

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項基金項目(BA 2007089)。

＊

過世東(1953-),男,江蘇無錫人,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事水產(chǎn)品加工與飼料工程研究。Email:Qianyuan fei 1984@yahoo.com.cn

(責(zé)任編輯:楊萌)