劉麗芳,張陽(yáng)德,伍參榮

(1.中南大學(xué)肝膽腸外科研究中心,湖南長(zhǎng)沙 410008;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,湖南長(zhǎng)沙 410007;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南長(zhǎng)沙 410208)

白礬、冰片系常用中藥,臨床應(yīng)用廣泛,歷史悠久。以白礬、冰片制備的礬冰液,在燒傷、皮膚病、靜脈炎、外科創(chuàng)面感染等疾病的治療方面取得了一定的療效。但礬冰液為淡黃色混懸液,是一種分散不均勻的給藥系統(tǒng),其中冰片水溶度差,易結(jié)晶析出,故生物利用度較低。納米乳作為藥物載體具有顯著提高藥物水溶性、分散性好、有利于機(jī)體吸收等優(yōu)點(diǎn)。本研究制備了白礬與冰片的O/W型復(fù)合納米乳,檢測(cè)了該納米乳體外抗菌活性并與傳統(tǒng)礬冰液進(jìn)行了比較,以期為礬冰納米乳的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 從臨床標(biāo)本中分離的12株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、10株表皮葡萄球菌(Staphylococcus epider m idis)、12株大腸埃希菌(Escherichia coli)、8株銅綠假單胞菌(Pseudom onas aeruginosa)、11株白假絲酵母菌(M onilia albicans)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)病原與免疫臨床教研室和湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)菌檢測(cè)中心分離、鑒定并提供;金黃色葡萄球菌ATCC25923株、大腸埃希菌ATCC25922株、銅綠假單胞菌ATCC27853株、白假絲酵母菌ATCC10231株由湖南中醫(yī)藥大學(xué)微生物室提供。1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯(瓊脂)培養(yǎng)基(杭州四季青生物試劑股份有限公司,批號(hào)2009010702)用于細(xì)菌培養(yǎng);含氯霉素沙保液體(瓊脂)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn),批號(hào)200909203)用于白假絲酵母菌培養(yǎng)。

1.1.3 藥物 礬冰納米乳由湖南中醫(yī)藥大學(xué)863課題組提供,規(guī)格16.3 mg/mL,批號(hào)20090610;礬冰液由湖南中醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室生產(chǎn),規(guī)格16.3 mg/mL,批號(hào)20090317;燙瘡油由湖南邵陽(yáng)華仁堂藥業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn),規(guī)格30 mL/瓶,批號(hào)090103;注射用頭孢氨芐粉針劑由哈藥集團(tuán)第三制藥廠生產(chǎn),規(guī)格1 g/瓶,批號(hào)20091001003,實(shí)驗(yàn)時(shí)用滅菌蒸餾水配成5μg/mL頭孢氨芐溶液,作為抗革蘭陽(yáng)性菌藥物對(duì)照;乳酸左氧氟沙星注射液由武漢神康醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格0.2 g/100 mL,批號(hào)2010022321,實(shí)驗(yàn)時(shí)用滅菌蒸餾水稀釋成20μg/mL,作為抗革蘭陽(yáng)性及革蘭陰性菌藥物對(duì)照;氟康唑由濟(jì)南中科一通化有限公司生產(chǎn),規(guī)格100 mg/50 mL,批號(hào)20091062302,實(shí)驗(yàn)時(shí)用無菌蒸餾水配成2μg/mL氟康唑溶液,作為抗白假絲酵母菌藥物對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂擴(kuò)散法 營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂或沙保瓊脂高壓滅菌后室溫中冷卻至50℃左右,分別取15 mL傾注于直徑10 cm滅菌平皿中,待瓊脂凝固后37℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行無菌檢查。取上述各菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液配制成1×105cfu/mL的懸液,各取100μL均勻涂布接種于檢菌合格的瓊脂平板上。用6 mm打孔器在平板上打孔,每平板4孔,然后分別加入試驗(yàn)藥礬冰納米乳及對(duì)照藥礬冰液、燙瘡油、頭孢氨芐、乳酸左氧氟沙星、氟康唑各300 μL/孔,37℃培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)定各藥物抑菌圈直徑并進(jìn)行比較。

1.2.2 M I C測(cè)定 采用2倍試管稀釋法。在滅菌試管中每管分別加入營(yíng)養(yǎng)肉湯或沙保液體培養(yǎng)基1.0 mL,對(duì)試驗(yàn)藥礬冰納米乳、對(duì)照藥礬冰液進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋,稀釋度1◇2～1◇32,使礬冰納米乳和礬冰液質(zhì)量濃度分別為4.08、2.04、1.02、0.51和0.26 mg/mL,分別加入1×105cfu/mL各菌懸液0.1 mL/管,37℃培養(yǎng)24 h觀察各藥物最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,M I C)。以50%和90%同種細(xì)菌菌株未見生長(zhǎng)的藥物最高稀釋度為M IC50和M IC90。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置加藥不加菌的藥物對(duì)照、加菌不加藥的菌株對(duì)照及不加藥不加菌的培養(yǎng)基對(duì)照。

1.2.3 殺菌試驗(yàn) 取5 mL礬冰納米乳、礬冰液原液分別加入1×106cfu/mL各細(xì)菌懸液或1×105cfu/mL白假絲酵母菌懸液500μL,37℃水浴分別孵育0.5、1、1.5、2、2.5、3和4 h后各取100 μL置滅菌平皿中,傾注15 mL加熱溶解冷卻至50℃左右的營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂或沙保瓊脂,37℃培養(yǎng)24 h,用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)并計(jì)算4 h內(nèi)減少菌數(shù)的對(duì)數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 礬冰納米乳對(duì)各菌株的抑制作用

瓊脂擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),同一菌種對(duì)不同藥物的敏感性有差異(P＜0.05,F檢驗(yàn));礬冰納米乳與礬冰液對(duì)臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株均有一定的抗菌作用,但礬冰納米乳強(qiáng)于礬冰液(P＜0.05,F檢驗(yàn))(圖1、表1和表2)。

表1 受試藥物對(duì)臨床菌株抑菌效果比較(ˉχ±s,n=9)Table 1 Comparison of inhibitory effects of the tested drugs against clinical strains

表2 受試藥物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌效果比較(ˉχ±s,n=9)Table 2 Comparison of inhibitory effects of the tested drugs against standard strains

圖1 受試藥物對(duì)不同菌株的抑菌圈Fig.1 Inhibitory rings of the tested drugs against different strains

2.2 M I C測(cè)定結(jié)果

礬冰納米乳對(duì)臨床分離的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌M I C90值分別為1.02、2.04和2.04 mg/mL,均低于礬冰液的M I C90值(P＜0.05,t檢驗(yàn));礬冰納米乳對(duì)臨床分離的表皮葡萄球菌、白假絲酵母菌的M IC90與礬冰液相同,均為1.02 mg/mL(P＞0.05,t檢驗(yàn))。見表3。

表3 礬冰納米乳與礬冰液M IC測(cè)定結(jié)果Table 3 Results ofM IC detection ofAlum-Borneol nanoemulsion and Alum-Borneol liquid

2.3 殺菌試驗(yàn)結(jié)果

礬冰納米乳或礬冰液作用不同受試菌1 h后,均顯示有殺菌作用,但礬冰納米乳強(qiáng)于礬冰液(P＜0.05,方差分析);同一作用時(shí)間內(nèi)礬冰納米乳對(duì)不同受試菌殺滅作用也強(qiáng)于礬冰液(P＜0.05,t檢驗(yàn))。見表4。

表4 礬冰納米乳與礬冰液殺菌作用Table 4 Bactericidal effects ofAlum-Borneol nanoemulsion and Alum-Borneol liquid

3 討 論

以白礬和冰片制備的外用中藥礬冰液具有清熱解毒、消腫止痛、生肌斂瘡作用[1],常用于皮膚感染、燒傷的臨床治療。有文獻(xiàn)報(bào)道,白礬有廣譜的抗菌作用,如對(duì)金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌等細(xì)菌以及白色念珠菌等真菌均有明顯的抑制作用,冰片對(duì)多種細(xì)菌及真菌也呈現(xiàn)劑量依賴性抗菌活性[2-3]。然而,冰片水溶性較差而易于析出,嚴(yán)重影響其生物利用度,采用白礬與冰片的O/W型復(fù)合納米乳藥物劑型,可明顯改善冰片水溶性而提高藥效。

瓊脂擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),礬冰納米乳對(duì)所有受試菌種的抑菌活性均明顯強(qiáng)于礬冰液(P＜0.05)(表1和表2);M I C測(cè)定試管法結(jié)果顯示表明,礬冰納米乳對(duì)臨床分離的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌M IC90值均低于礬冰液(P＜0.05),表明前者抑菌能力明顯強(qiáng)于后者;殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明,礬冰納米乳或礬冰液與金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌混合作用1 h后,活菌數(shù)均有所下降,但礬冰納米乳作用后活菌數(shù)下降程度明顯高于礬冰液(P＜0.05)(表4)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,礬冰納米乳與礬冰液均有廣譜體外抑菌及殺菌活性,由于我們采用的礬冰納米乳和礬冰液中白礬及冰片劑量相同,表明將白礬及冰片復(fù)合物納米化可提高抗菌效果。

如前所述,礬冰納米乳體外抗菌作用明顯強(qiáng)于白礬及冰片含量相同的礬冰液,尤其對(duì)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌抗菌效果提升作用更為明顯,其原因可能有以下幾點(diǎn)：①礬冰納米乳提高了冰片的溶解度和生物利用度,使冰片的抗菌活性增強(qiáng);②礬冰納米乳液滴粒徑小于50 nm,表面張力低,浸潤(rùn)性、鋪張性好,更易于附著并滲入菌體內(nèi)發(fā)揮抑菌或殺菌作用[4];③納米乳本身對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌也有一定的損傷作用[5]。金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌均為皮膚感染疾病、燒傷病人常見病原菌,我們的實(shí)驗(yàn)證明礬冰納米乳體外抗菌效果明顯優(yōu)于礬冰液,顯示了礬冰納米乳廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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[2] 黃曉敏,廖玲軍,曾松榮,等.梅花冰片3種劑型體外抗菌活性研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,17(1)：63-65.

[3] 趙曉洋,蝎福,葛榮明,等.冰片抗真菌作用的超微結(jié)構(gòu)觀察[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1992,20(3)：295-297.

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