閆志勇,畢春霞,辛?xí)阅?羅 瑋,代玉梅,王 斌

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,山東青島 266071;2.青島市立醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東青島 266071)

1株高產(chǎn)蛋白酶嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的分離鑒定及其酶學(xué)活性的研究

閆志勇1,畢春霞2,辛?xí)阅?,羅 瑋1,代玉梅1,王 斌1

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,山東青島 266071;2.青島市立醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東青島 266071)

雙齒圍沙蠶消化道中分離 1株高產(chǎn)蛋白酶菌株 D2(CG MCC保藏號(hào):1868),經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析確定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。Lowry法檢測(cè)顯示該菌株產(chǎn)酶能力為1 104 U/mL,最佳產(chǎn)酶條件為 pH 8.0、25℃培養(yǎng) 48 h;酪蛋白酶圖譜法和凝膠成像分析證實(shí)其蛋白酶分子量約為 42 ku,在培養(yǎng)上清液中純度大于 97%;該酶對(duì)粗酶品比活性為 301 U/mg,酶活性的最適 pH值為 9,是一種堿性蛋白酶;最適溫度為 60℃;在 55℃以下及 pH 6～10的環(huán)境中具有較好的穩(wěn)定性。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株有望成為一種新的蛋白酶生產(chǎn)資源。

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌;鑒定;蛋白酶;活性

蛋白酶是一類能水解蛋白質(zhì)肽鏈的催化酶,已廣泛應(yīng)用于食品、釀造、飼料、醫(yī)藥、紡織、日用化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域,是目前世界上產(chǎn)銷量最大的商業(yè)酶[122]。該酶廣泛分布于動(dòng)物、植物及微生物中。20世紀(jì) 90年代以來(lái)隨著發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展,微生物已日益成為工業(yè)酶制劑的主要來(lái)源,而海洋微生物由于其生存的特殊環(huán)境,分泌的各種酶類往往具有諸如作用pH和溫度范圍廣、活性相對(duì)穩(wěn)定等特性,已成為新型生物酶開(kāi)發(fā)的主要資源[324]。近年來(lái)我國(guó)蛋白酶研究取得了較大進(jìn)展,但還存在如產(chǎn)酶微生物資源開(kāi)發(fā)不足,蛋白酶種類單一等諸多問(wèn)題,因此研究的重點(diǎn)仍在于新品種的篩選。本文從海洋生物雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis Grube)消化道中分離出 1株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (Stenotrophom onas m altophilia),可大量分泌某堿性蛋白酶,且在培養(yǎng)液中具有較高濃度和純度,利于分離純化和大規(guī)模生產(chǎn);此外,該酶還具有較寬的活性溫度和 pH范圍。菌株D2已被中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心收藏 (保藏號(hào) CG MCC 1868),并有望成為 1株新的具有研究開(kāi)發(fā)潛力的蛋白酶生產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 雙齒圍沙蠶采集自青島膠洲灣近海海岸的泥沙中。將活的沙蠶用無(wú)菌海水洗凈后置于無(wú)菌海水中 24 h使其排凈腸道中的代謝物,解剖分離出消化道,用棉拭蘸取內(nèi)容物接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng) 24 h,分離單個(gè)菌落。

1.1.2 主要試劑 基因組 DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、pGEM2T Easy載體、Folin2酚、酪蛋白等購(gòu)自 Promega公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.1.3 主要儀器 凝膠成相系統(tǒng) (UVP GDS8000)、低溫高速離心機(jī) (Eppendorf)、冷凍水浴循環(huán)儀 (S IM)和真空冷凍干燥儀 (S IM)等。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)胞外蛋白酶菌株的初步篩選 將從沙蠶消化道分離出的 9株細(xì)菌點(diǎn)種于脫脂奶粉平板,25℃孵育 48 h后觀察菌落周圍溶圈直徑。

1.2.2 菌株的形態(tài)和生理學(xué)鑒定 將篩選出的高產(chǎn)蛋白酶菌株 D2進(jìn)行革蘭染色、透射電子顯微鏡觀察形態(tài)。生長(zhǎng)溫度、NaCl及 pH耐受性、碳源利用及其他生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

1.2.3 菌株的 16S rRNA基因序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌株接種于 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,基因組 DNA提取試劑盒 (Promega)提取DNA。設(shè)計(jì) 16S rRNA基因擴(kuò)增引物,正向引物為5′2AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′,反 向 引 物 為5′2AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA23′,分別對(duì)應(yīng)于大腸埃希菌 16S rRNA基因 (GenBank J01695)的第 8～27位和第 1 519～1 541位核苷酸,由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系 (50μL):模板 2.0μL,TaqDNA聚合酶 0.5 μL,10×PCR緩沖液 5μL,MgCl2(25 mmol/L)5.0μL,dNTP(2.5 mmol/L each)5.0μL,引物(10μmol/L)各 2.0μL;擴(kuò)增條件:94℃ 6 min后,94℃45 s,54℃45 s,72℃90 s,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸 10 min。將 PCR純化產(chǎn)物連接到pGEM2T Easy載體上,轉(zhuǎn)化 E.coliJM109,提取質(zhì)粒后,AB 3730自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。將菌株獲得的D2 16S rRNA基因序列與 GenBank已收錄的細(xì)菌基因序列進(jìn)行比較;利用 CLUSTAL X(1.83)與其他相關(guān)細(xì)菌序列進(jìn)行對(duì)比,選用 MEGA(3.0)軟件 Kimura 22parameter距離模型進(jìn)行 NJ分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)育樹(shù)用 Bootstrap法 (重復(fù)數(shù)為1 000)檢驗(yàn)。

1.2.4 菌株 D2培養(yǎng)液中蛋白酶活性成分的確定 將菌株接種到牛肉膏培養(yǎng)基 (0.3%牛肉膏,1.0%蛋白胨,0.5%NaCl,pH 7.2)中 25℃振蕩培養(yǎng) 24 h,13 000 r/min 4℃離心 15 min,取上清用濾菌器 (0.20μm)除菌后進(jìn)行 SDS2PAGE電泳,觀察培養(yǎng)液中的蛋白成分,并用 UVP凝膠成像系統(tǒng)對(duì)蛋白進(jìn)行分子量和純度分析,并采用酪蛋白酶圖譜法[6]確定具有蛋白酶活性的組分:將樣品加等體積非還原性載樣緩沖液混合,取 30 μL加樣于含 0.8%酪蛋白的 SDS2聚丙稀酰胺凝膠 (15%),電泳后將凝膠用蒸餾水沖洗干凈,浸入復(fù)性緩沖液振蕩作用 30 min,換液后重復(fù) 3次,加入孵育緩沖液 25℃過(guò)夜,考瑪斯亮藍(lán) R2250染色液染色,脫色后觀察。

1.2.5 菌株 D2產(chǎn)蛋白酶條件的檢測(cè) 分別測(cè)定菌株 D2在不同培養(yǎng)時(shí)間、不同培養(yǎng)溫度及不同起始 pH值培養(yǎng)基等條件下菌液上清中蛋白酶活性,以確定其產(chǎn)蛋白酶的最佳條件。蛋白酶活性測(cè)定采用改良 Folin2酚法[7],酶活力單位為 40℃條件下每分鐘水解酪素產(chǎn)生相當(dāng)于 1μg酪氨酸所需的酶量。

1.2.6 D2蛋白酶性質(zhì)的初步檢測(cè) 取菌株 D2培養(yǎng)液少許離心,濾菌后測(cè)定上清的蛋白酶活力 (U/mL);其余培養(yǎng)液真空冷凍干燥,蒸餾水溶解后過(guò)濾除菌,過(guò)夜透析,透析液再次冷凍干燥獲得蛋白酶粗提物,稱重。用不同 pH緩沖液定量稀釋,40℃下測(cè)定酶活性的 pH值曲線。在確定的最適酶活性 pH值條件下測(cè)定其溫度曲線和比活性(U/mg)。

2 結(jié) 果

2.1 菌株 D2的生物學(xué)特征

革蘭染色和透射電鏡觀察顯示,菌株 D2為革蘭陰性菌,多數(shù)為桿狀,兩端鈍圓,大小約為0.5～1.0μm ×2～4μm,不規(guī)則散在排列,菌體的一端有 1～4根鞭毛 (圖1)。菌株 D2為專性需氧菌,亞胺培南耐藥,觸酶、麥芽糖分解、明膠液化、β2半乳糖苷酶試驗(yàn)陽(yáng)性,氧化酶、靛基質(zhì)、脲酶陰性,不分解葡萄糖、甘露醇等產(chǎn)酸,上述結(jié)果與嗜麥寡養(yǎng)單胞菌的主要特性一致。此外,該菌株的最適生長(zhǎng)溫度、pH值和 NaCl濃度分別為 28℃、8.5和 1.0%。

2.2 菌株D2的 16S rRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株D 2的16 S rRNA基因序列長(zhǎng)為1539 bp,序列見(jiàn) GenBank DQ839619。與該基因序列一致性 (identity)最高的為嗜麥寡養(yǎng)單胞菌,為99%;同時(shí),系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,菌株 D2與其他嗜麥寡養(yǎng)單胞菌位于同一分支 (圖2)。結(jié)合 2.1結(jié)果,確定該菌為嗜麥寡養(yǎng)單胞菌,菌株已被中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏,保藏號(hào) CG MCC No.1868。

圖1 電鏡下的菌株 D2Fig.1 Trans mission electron micrograph of strain D2

圖2 D2及相關(guān)菌株的 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic tree of strain D2 and related strains based on 16S rRNA gene sequences

2.3 菌株 D2培養(yǎng)液中蛋白酶活性成分的分離與確定

將菌株 D2培養(yǎng)液上清 SDS2PAGE電泳后發(fā)現(xiàn),只有 1條純度較高蛋白帶;凝膠成像系統(tǒng)分析顯示,其大小約為 42 ku,純度 >97%(圖3 A)。酪素酶譜結(jié)果顯示,在同樣大小的位置,底物被消化形成一明顯的透明帶 (圖3 B),表明該蛋白帶具有顯著蛋白酶活性。

2.4 D2蛋白酶的活性檢測(cè)及作用特點(diǎn)

菌株D2培養(yǎng)上清液中蛋白酶活力為 (1 104 U/mL),其粗酶品的蛋白酶比活性為 301 U/mg。D2蛋白酶在 pH 7～10范圍內(nèi)酶活性均維持在最大酶活性的 65%以上;其最適 pH為 9,故是一種堿性蛋白酶 (圖4)。該酶的最適溫度為 60℃,在10～90℃范圍內(nèi)均具有一定活性 (圖5)。

2.5 菌株D2的產(chǎn)蛋白酶的條件

菌株D2在培養(yǎng) 48 h后酶活力達(dá)到最高,產(chǎn)酶的最佳起始 pH值和培養(yǎng)溫度分別為 8.0和25℃。

圖3 菌株 D2培養(yǎng)液上清的SDS2PAGE電泳(A)及酪素酶譜分析(B)Fig.3 SDS2PAGE ofD2 fermental supernatant(A)and Casin2Zymogram of proteinase(B)1:菌株 D2的培養(yǎng)液上清;2:空白培養(yǎng)基;M:低分子量蛋白Marker

3 討 論

圖4 D2蛋白酶活性的 pH值曲線Fig.4 Effect of pH on protease activity

圖5 D2蛋白酶活性的溫度曲線Fig.5 Effect of temperature on protease activity

目前某國(guó)內(nèi)外的蛋白酶生產(chǎn)菌株多是從土壤、溫泉水等樣本中篩選出的。由于所處的獨(dú)特環(huán)境,從海洋或海洋生物中分離出的嗜熱 /冷、嗜鹽、嗜酸 /堿、高壓等的微生物已成為新型生物學(xué)活性酶開(kāi)發(fā)的主要資源。目前已報(bào)道的海洋產(chǎn)蛋白酶菌株包括假單胞菌、副溶血弧菌和黃桿菌等[4]。

雙齒圍沙蠶生活在海邊潮間帶,由于其主要以廢水里的有機(jī)物為食被稱為“泥灘的清潔工”,因此推測(cè)其體內(nèi)可能具有多種生物活性物質(zhì)或微生態(tài)菌群以助其抵抗外界污染環(huán)境的損害。近幾年研究人員陸續(xù)從沙蠶體內(nèi)分離出多種生物活性物質(zhì)[8],本文從其消化道中分離出產(chǎn)蛋白酶菌 D2株,經(jīng)鑒定證實(shí)為嗜麥芽窄食單胞菌。嗜麥芽窄食單胞菌分布廣泛,具有很強(qiáng)的代謝活性及廣泛的適應(yīng)能力,是醫(yī)院感染的植物致病的常見(jiàn)菌。自上世紀(jì) 90年代末開(kāi)始,研究人員陸續(xù)從不同來(lái)源的該菌中分別分離出蛋白酶、脂肪酶、纖溶酶、核苷酸氧化酶、L2多巴等各種生物活性蛋白[9210],其中相當(dāng)一部分產(chǎn)物因具有不同的生物學(xué)活性,而具有很大的應(yīng)用潛力和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

D2蛋白酶比活性為 301 U/mg,與報(bào)道的多數(shù)其他蛋白酶相當(dāng),但 D2株具有較高產(chǎn)酶能力,未經(jīng)誘變的原始菌在液體培養(yǎng)基中能分泌大量的胞外蛋白酶,上清液中酶的活性達(dá) 1 104 U/mL,未經(jīng)濃縮的培養(yǎng)液直接進(jìn)行 SDS電泳即可觀察到高濃度的酶蛋白帶,且條帶單一,在上清中純度高達(dá)總蛋白的 97%,非常適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和分離純化。對(duì)粗酶的研究顯示,D2蛋白酶在pH 7～10范圍內(nèi)酶活性均維持在最大酶活性的65%以上,是一種堿性蛋白酶;酶的最適溫度為60℃,但在 10～90℃范圍內(nèi)均具有一定活性,活性溫度范圍廣,而已報(bào)道的海洋細(xì)菌蛋白酶多為低溫酶[3],其他來(lái)源的微生物蛋白酶則活性范圍一般較窄。目前,已通過(guò)層析技術(shù)獲得了小量 D2蛋白的酶的純品,正在探索其最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件,從而為規(guī)?；l(fā)酵和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and Identification of a High2Protease2Producing Stenotrophom onas m altophiliaStra in and Its Enzymatic Characteristics

YAN Zhi2yong1,B IChun2xia2,XIN Xiao2ni1,LUO Wei1,DA I Yu2mei1,WANGBin1
(1.Dept.of M icrobiol.,Med.Coll.,Qingdao Uni.;2.QingdaoM unicipal Hosp.,Qingdao266071)

A high2protease2producing bacteria,strain D2(CG MCC 1868),was isolated from the alimentary tract of Perinereis aibuhitensis.Based on the study of itsmorphologic and physiological properties,and phylogenetic analyses of the 16S rRNA gene sequence,strain D2 was confirmed to beStenotrophomonas m altophilia.Lowry method deter2 mined the enzymatic production capacity of the strain reached as high as 1 104 U/mL for 48 h2fer mentation in an opti2 mized production condition of pH 8.0 and 25℃.The enzyme was proved itsmolecularmass being 42 ku analyzed by casease atlasmethod and gel image,and its purity in fer mentation broth wasmore than 97%,the specific activity of the enzyme to the crude enzymewas301 U/mg.themost suitable pH of the enzymewas at9,being an alkaline prote2 ase,the most suitable temperature was 60℃,and fairly good stability at pH 6～10 and 0～55℃.Therefore,D2 strain might be a novel promising resource ofmarine microbial protease.

Stenotrophom onas m altophilia;identification;protease;activity

Q939

A

1005-7021(2010)05-0007-05

國(guó)家“973”計(jì)劃基礎(chǔ)前期研究專項(xiàng)(2004CCA02400);山東省科技公關(guān) (2007GG3WZ05009);青島市自然科學(xué)基金(072223282jch)

閆志勇 男,副教授,博士。主要從事細(xì)菌生物活性基因的分子生物學(xué)研究。

Tel:0532283780059,E2mail:yanzhiyong2001@126.com

2010208210;

2010209222