黃春敏,沈 微,王正祥

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院生物資源與生物能源研究中心和教育部工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

高溫α-淀粉酶是一種內(nèi)切型淀粉酶,能隨機(jī)水解淀粉質(zhì)原料及其降解物內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵。因具有反應(yīng)溫度高、熱穩(wěn)定性好等特性而被廣泛應(yīng)用于酒精、白酒、啤酒等食品發(fā)酵工業(yè)中和紡織業(yè)高溫退漿。地衣芽胞桿菌是公認(rèn)的具有重要工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值的生產(chǎn)菌株,在酶制劑工業(yè)中已使用數(shù)十年。但目前生產(chǎn)所使用的菌株大多是野生菌株經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)遺傳改良獲得的突變株,容易出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)[1]。在以前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：地衣芽胞桿菌中通過(guò)游離質(zhì)粒增加BLA編碼基因的劑量可以顯著提高BLA的發(fā)酵速率和產(chǎn)酶水平[2];通過(guò)定向基因整合的方法也可以有效提高BLA的產(chǎn)率[3]。同時(shí)在研究中也發(fā)現(xiàn),在特定地衣芽胞桿菌的染色體中,實(shí)現(xiàn)BLA編碼基因的整合與基因擴(kuò)增并不容易發(fā)生。為此,本研究構(gòu)建了一種基于16S rDNA序列為整合位點(diǎn)的am yL重組表達(dá)載體,采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入地衣芽胞桿菌CBBD302中,通過(guò)16S rDNA序列實(shí)現(xiàn)BLA編碼基因的整合與基因擴(kuò)增,由此獲得了BLA生產(chǎn)水平顯著提高的重組菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Escherchia coliJM109(CI CIMB0012)、Escherchia coliJM109(pLakr)、B acillus lichenifor m isCBBD302由江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息中心(http：//cicim-cu.jiang nan.edu.cn)提供。pBL-amyL[3]、pSKsym-EryR[4]為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①大腸埃希菌和地衣芽胞桿菌的培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基,需要時(shí)加入卡那霉素至50μg/mL或紅霉素至150μg/mL用于重組大腸埃希菌篩選,加入適量紅霉素用于地衣芽胞桿菌的篩選;②地衣芽胞桿菌轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基：416#培養(yǎng)基、2×S MM、Penassy培養(yǎng)基、S MMP、40%的PEG6000以及再生培養(yǎng)基DM3均參考文獻(xiàn)[5]配置;③發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿40 g/L,硫酸銨30 g/L,乳糖30 g/L;調(diào)pH 7.0。發(fā)酵試驗(yàn)在250 mL三角瓶中進(jìn)行,培養(yǎng)基裝液量為50 mL,200 r/min搖床培養(yǎng)120 h。

1.1.3 主要試劑 DNA限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Sm aⅠ、B amHⅠ、B glⅡ、PstⅠ以及卡那霉素、紅霉素、PEG6000,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;T4DNA連接酶,深圳晶美生物工程有限公司;X-Gal、IPTG,寶生物工程有限公司;PCR產(chǎn)物(小量)純化試劑盒、膠回收試劑盒,博大泰克公司;其他試劑藥品皆為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的分析純和生化試劑。

1.1.4 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(B IO-RAD公司生產(chǎn)),紫外分光光度計(jì)(UN ICO公司生產(chǎn)產(chǎn)品,型號(hào)UV-2000),垂直板狀電泳系統(tǒng)(B IO-RAD公司生產(chǎn)),Alpha Innotech凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha Innotech公司生產(chǎn)),臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn),型號(hào)1-15),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn),型號(hào)4K15)。

1.2 方法

1.2.1 DNA操作技術(shù) 地衣芽胞桿菌染色體DNA的提取,質(zhì)粒提取、酶切,大腸埃希菌感受態(tài)制備、CaCl2法轉(zhuǎn)化等操作參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。DNA片段膠回收、PCR產(chǎn)物純化用博大泰克試劑盒進(jìn)行。B.lichenifor m is16S rDNA的PCR通用引物L(fēng)1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、L2：ACGGCTACCTTGTTACGACTT,PCR反應(yīng)基本條件：95℃,5 min;94℃,50 s,56℃,90 s,72℃,60 s,35個(gè)循環(huán);72℃,10 min。

1.2.2 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)[7]的方法,并根據(jù)B.licheniformis CBBD302的特性對(duì)原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。挑取單菌落接種于25 mL 416#培養(yǎng)基中,過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接1 mL到新鮮的416#培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)約4 h。離心收集菌液,用5 mL S MMP懸浮菌體,加入適量溶菌酶,37℃培養(yǎng)至90%的細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體,1 900 r/min離心10 min。棄上清,將收集的菌體重懸于5 mL S MMP中,隨后依次加入5～10μL質(zhì)粒、等體積的2×S MM緩沖液和2 mL 40%PEG6000,輕輕混勻后,再加入10 mL的S MMP,2 000 r/min離心10 min。棄上清,再加入500μL S MMP,30℃,100 r/min培養(yǎng)150 min。涂布于含抗性的DM3再生培養(yǎng)基上。

1.2.3 高溫α-淀粉酶酶活的測(cè)定以及表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 高溫α-淀粉酶酶活測(cè)定參照國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T2306-97進(jìn)行[8]。1個(gè)酶活單位定義為在90℃、pH 6.0的條件下1 min液化1 mg淀粉成為糊精所需的酶量。酶活以1 mL發(fā)酵液中的高溫α-淀粉酶酶活計(jì)算,用U/mL表示。SDS-PAGE分析參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 整合表達(dá)通用性質(zhì)粒pBli16s-amyL-EryR的構(gòu)建

以B.licheniform is染色體DNA為模板,用通用引物L(fēng)1、L2擴(kuò)增出B.licheniform is的16S rDNA,純化后與經(jīng)Sm aⅠ酶切的載體pLakr連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞,在含有50μg/mL卡那霉素的藍(lán)白平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,獲得重組質(zhì)粒pLa-Bli16s。重組質(zhì)粒pLa-Bli16s經(jīng)B amHⅠ酶切、pBL-amyL經(jīng)BglⅡ酶切后膠回收1.88 kb的am yL片段,兩者連接并轉(zhuǎn)化E.coliJM109,在含有50μg/mL卡那霉素的淀粉平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,獲得轉(zhuǎn)化子pB-li16s-amyL,并提取質(zhì)粒用PstⅠ酶切驗(yàn)證。將pB-li16s-amyL用Sm aⅠ酶切,pSKsym-EryR經(jīng)Sm aⅠ酶切回收1.1 kb的EryR片段,兩者連接并轉(zhuǎn)化E.coliJM109,在含有50μg/mL紅霉素的淀粉平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,得到整合表達(dá)質(zhì)粒pBli16samyL-EryR(圖1)。

圖1 整合表達(dá)通用性質(zhì)粒pBli16s-amyL-EryR的構(gòu)建Fig.1 Construction of the common integrated expression plasmid pBli16s-amyL-EryR

2.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

用帶有卡那、紅霉素抗性的質(zhì)粒pBli16samyL-EryR轉(zhuǎn)化B.licheniform isCBBD302。將所得的轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種到無(wú)抗和含有卡那霉素、紅霉素雙抗的淀粉平板上,觀察透明圈大小,挑取透明圈較原菌大的菌落分離純化、發(fā)酵測(cè)酶活,酶活比原菌高10%及以上的即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。地衣芽胞桿菌原生質(zhì)體再生困難、限制修飾系統(tǒng)復(fù)雜等特殊生理、遺傳性狀,使其分子改良難度大大提高[9],其遺傳轉(zhuǎn)化至今仍是一大難點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明,相同條件下選擇對(duì)數(shù)中后期的菌體有利于原生質(zhì)體的再生;在制備原生質(zhì)體時(shí),溶菌酶終濃度為1μg/mL,作用時(shí)間為25～30 min,原生質(zhì)體形成約90%,其轉(zhuǎn)化子數(shù)量最多為20～50 cfu/μgDNA;當(dāng)原生質(zhì)體形成率成過(guò)高或過(guò)低,都不利于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化或再生;在整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中動(dòng)作要輕柔,采用低速離心,防止原生質(zhì)體破裂。發(fā)酵試驗(yàn)表明,再生平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子假陽(yáng)性極高,可能是在原生質(zhì)體形成和再生過(guò)程中細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞,使抗生素篩選效果大大降低。

2.3 整合表達(dá)目的基因拷貝數(shù)的提高

本實(shí)驗(yàn)采用地衣芽胞桿菌16S rDNA作為同源臂進(jìn)行整合,而在地衣芽胞桿菌染色體上16S rDNA的整合位點(diǎn)有幾十個(gè),大大提高了整合轉(zhuǎn)化的效率,而且可以反復(fù)轉(zhuǎn)化,以提高目的基因的拷貝數(shù)。但是由于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率低、假陽(yáng)性高,因而本實(shí)驗(yàn)采用在一定范圍內(nèi)提高液體培養(yǎng)基中抗生素的使用濃度,增加新生子代染色體中同源序列不等位交換,從而增加目的基因在宿主染色體上的基因拷貝數(shù)(圖2)。在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中,隨機(jī)挑取20株在含不同濃度紅霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)與誘導(dǎo),并轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基。酶活測(cè)定結(jié)果如表1所示。

圖2 α-高溫淀粉酶在染色體上的擴(kuò)增模式Fig.2 The multiplication mode of thermophilicα-amylase in Chromosomes

表1 轉(zhuǎn)化子在不同濃度紅霉素誘導(dǎo)下的α-淀粉酶相對(duì)活力Table 1 Relativeα-amylase activity of transformations in induction of different concentrations of erythromycin

由表1可知：不同的轉(zhuǎn)化子對(duì)抗性的敏感性不同,在不同濃度紅霉素的誘導(dǎo)下,轉(zhuǎn)化子酶活提高了56.37%～80.29%。在低濃度下,酶活隨著抗性增加而非線性提高,這是因?yàn)榈矸勖富虬夥置诒磉_(dá)受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯效率、肽鏈折疊等諸多因素影響;紅霉素濃度過(guò)高,抑制轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)或產(chǎn)生不可逆的變化,使其酶活大大降低。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

取酶活最高的發(fā)酵液與原菌做SDS-PAGE分析表明,目的條帶大小與報(bào)道的地衣芽胞桿菌高溫α-淀粉酶分子量55 ku左右相一致,胞外產(chǎn)BLA水平明顯提高(圖3)。由于BLA的大量分泌表達(dá),胞外其他蛋白分泌量也發(fā)生了變化。

圖3 發(fā)酵液的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of the proteins in broth

3 討 論

通過(guò)基因工程手段提高淀粉酶分泌的方法主要有強(qiáng)化啟動(dòng)子功能、提高基因拷貝數(shù)等。Paval等[10]通過(guò)提高α-淀粉酶基因拷貝數(shù),使枯草芽胞桿菌野生菌株α-淀粉酶分泌能力提高了2 500倍;牛丹丹等[11]通過(guò)多拷貝游離質(zhì)粒和染色體整合分別將大腸埃希菌、地衣芽胞桿菌分泌的β-甘露聚糖酶活提高了15～18倍和5～7倍;Waldeck J等[12]通過(guò)多拷貝游離質(zhì)粒載體表達(dá)異源淀粉酶基因發(fā)現(xiàn)突變株表達(dá)異源淀粉酶的水平明顯提高,同時(shí)細(xì)胞自身表達(dá)的蛋白酶活力也顯著提高。實(shí)驗(yàn)證明提高酶編碼基因拷貝數(shù)是提高其合成與分泌的最有效方法之一。從理論上講,抗性濃度增加,目的基因的拷貝數(shù)增加,酶活會(huì)相應(yīng)提高,但是目的基因的分泌表達(dá)是個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程,受到操縱子調(diào)控、細(xì)胞監(jiān)控、能量再生、分泌調(diào)控等因素限制,因此找到不同轉(zhuǎn)化子的最合適的抗性是實(shí)現(xiàn)目的基因高效表達(dá)的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)正是試圖通過(guò)改變培養(yǎng)基中抗性使用濃度,篩選出目的基因的高效表達(dá)的轉(zhuǎn)化子。最終轉(zhuǎn)化子在其合適的抗性濃度下酶活都得到了較大的提高,為56.37%～80.29%。此外,通過(guò)SDS-PAGE分析表明地衣芽胞桿菌胞外分泌表達(dá)量可能存在極限。

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