蔣金龍 王姝硯 繆曉青

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蜂膠揮發(fā)油提取及其DPPH自由基清除率的研究

蔣金龍 王姝硯 繆曉青*

福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所

蜂膠（propolis）是蜜蜂用從植物的嫩芽及樹(shù)干上采集的樹(shù)脂并混入自身上顎腺分泌物和蜂蠟混合而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物[1]。蜂膠成分極為復(fù)雜，主要由55%的樹(shù)脂樹(shù)香復(fù)合物、30%的蜂蠟、10%的芳香揮發(fā)油和5%的花粉及其它物質(zhì)混合組成的[2]。蜂膠中的揮發(fā)油雖然含量較少，但也是一類非常重要的活性成分，具有獨(dú)特的芳香氣味和一定的生物學(xué)功能及藥理學(xué)作用[3]。Melliou等[4](2007)報(bào)道了五種希臘蜂膠的揮發(fā)性成分具有良好的抗細(xì)菌和真菌的功效。

目前蜂膠精油的提取方法常見(jiàn)的有：水蒸汽蒸餾法，固相微萃取法，溶劑提取法，超聲波輔助萃取，微波爐輔助萃取及超臨界CO2萃取等[5]。由于固相微萃取法及超臨界萃取成本比較高，而溶劑提取法和水蒸汽蒸餾法提取率較低，故本文采用超聲和微波這兩種普及率高且成本低的輔助技術(shù)來(lái)提取蜂膠揮發(fā)油。許多植物揮發(fā)油易溶于石油醚等極性小的有機(jī)溶劑中，也能溶于高濃度乙醇所以，本文研究主要采用石油醚，己烷，乙醚三種溶劑來(lái)提取蜂膠中的揮發(fā)油，并對(duì)其提取工藝和抗氧化能力進(jìn)行比較研究。

1 材料與儀器

材料：蜂膠（原膠）由福建神蜂技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供；DPPH產(chǎn)自于日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，乙醇、石油醚、乙醚、己烷等均為分析純?cè)噭?/p>

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52C5-2，上海亞榮生化儀器廠；微波爐MM823ESJ-PA(輸出功率為800W)，廣東美的微波爐制造有限公司；超聲波清洗器KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平BS223S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)WFJ 7200，尤尼柯（上海）儀器有限公司；等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原料制備

蜂原膠置于-18℃環(huán)境條件下冷凍12小時(shí)，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成100目以上的粉末后，按料液體積比為1：4加入90%乙醇，在40℃條件下超聲回流攪拌提取3次，時(shí)間為4h，過(guò)濾除雜后合并濾液，放入4℃條件下靜置12小時(shí)，讓其自然析出蜂蠟，過(guò)濾后真空抽濾得到精蜂膠。得率為40.2%。

2.2 蜂膠揮發(fā)油超聲波提取

取蜂膠（精膠）20克，加入5mL無(wú)水乙醇進(jìn)行完全溶解，再分別加入溶劑石油醚、己烷，料液比為1﹕20，提取兩次，過(guò)濾后用溶劑洗滌殘?jiān)?，合并濾液后置于冰箱冷凍4個(gè)小時(shí)以上，待其析出蜂蠟后再過(guò)濾，如此反復(fù)冷凍過(guò)濾直到無(wú)蠟質(zhì)析出為止。濾液在45℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)濃縮脫溶得到揮發(fā)油；另取毛膠50克，直接加入400mL的無(wú)水乙醇，其它步驟同上述條件。稱其重量計(jì)算得率，每溶劑平行三次實(shí)驗(yàn)，取其平均值。

2.3 微波－超聲波萃取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)所得的的結(jié)果，以料液比、微波功率、超聲波萃取時(shí)間、超聲波萃取溫度為試驗(yàn)因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

表1 蜂膠揮發(fā)油提取L9（34）因素水平表

2.4 蜂膠揮發(fā)油抗氧化性能的測(cè)定

2.4.1揮發(fā)油溶液與DPPH乙醇溶液的配制

揮發(fā)油的配制：準(zhǔn)確稱0.050g揮發(fā)油，用無(wú)水乙醇定容到置于100 mL的容量瓶中，得濃度為0.5mg/mL的蜂膠揮發(fā)油樣液，再將其配制成0.5、0.05、0.01、0.005mg/mL系列濃度，精制蜂膠與BHT同法配制成相同系列濃度作為參考。

自由基的配制：精密稱取DPPH自由基 0.2561g，無(wú)水乙醇溶解 ,并定容1000mL ,搖勻得濃度為 256.1mg/LDPPH儲(chǔ)備液，冷藏備用 ,使用前用無(wú)水乙醇稀釋至濃度為 25.61 mg/L。

2.4.2揮發(fā)油自由基清除能力的測(cè)定

采用 DPPH自由基清除能力來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化活性[6,7]。從容量瓶中吸取濃度為0.5mg/mL揮發(fā)油2mL置于試管中，再取DPPH乙醇溶液2mL并用無(wú)水乙醇定容5 mL均勻混合，室溫避光1h后采用分光光度法在517nm下測(cè)定其吸光度。以自由基的清除率作為抗氧化能力指標(biāo)，每一吸光度平行3次測(cè)定，依照下式計(jì)算清除率：

式中 A0：2mL試樣空白溶劑+加入2mLDPPH乙醇溶液的吸光度；A1：2mL樣品溶液溶劑+加入2mLDPPH乙醇溶液的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同溶劑揮發(fā)油超聲波提取

石油醚、己烷、乙醚三種溶劑在相同條件下提取蜂膠揮發(fā)油的平均得率分別為：10.09%，8.95%，7.76%，石油醚的提取率是最高的。

3.2 微波－超聲波輔助提取揮發(fā)油的正交試驗(yàn)

表2 微波－超聲波輔助提取揮發(fā)油正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2的結(jié)果和極差分析可以看出，各因素對(duì)提取蜂膠率大小的影響由大到小依次為A>C>B>D，即料液比 >超聲波提取溫度>微波功率大小>超聲提取時(shí)間，結(jié)合表中的提取率大小綜合考慮，蜂膠揮發(fā)油提取率最好的一組是 A2B2C2D1，即料液比為1∶20，提取溫度40℃，微波功率選擇中檔（輸出功率為800W），提取時(shí)間15min。

3.3 蜂膠揮發(fā)油清除DPPH的測(cè)定

表3 不同溶劑揮發(fā)油提取物的DPPH自由基清除效果

表3為蜂膠醇提物、3種揮發(fā)油和BHT在不同濃度時(shí)清除DPPH自由基的清除效果，圖1為樣品濃度0.005mg/mL～5mg/mL時(shí)，揮發(fā)油試樣濃度與DPPH清除率之間的關(guān)系；圖2為蜂膠揮發(fā)油及對(duì)照樣品在0.5和0.01mg／mL時(shí)不同清除率的比較結(jié)果。

圖1 DPPH清除活性與樣品濃度關(guān)系曲線

圖2 揮發(fā)油、蜂膠醇提物及BHT在濃度5mg/mL，0.01mg/mL時(shí)的抗氧化活性

結(jié)果表明，相對(duì)BHT抗氧化活性而言，蜂膠乙醇提取物具有很高的自由基清除能力，而三種蜂膠揮發(fā)油都具有一定的清除DPPH自由基的抗氧化活性，其中石油醚提取物的抗氧化活性最高，乙醚的相對(duì)最低。從圖1可以看出，不同溶劑提取的蜂膠揮發(fā)油樣品隨著濃度的增大，提高抗氧化性的增強(qiáng)的幅度不一。其中石油醚提取物和乙醚提取物表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系；在濃度大于0.05mg/mL時(shí)，石油醚提取物，蜂膠乙醇提取物和BHT抗氧化效果極為相似；五個(gè)試樣在溶液中的濃度大于0.5mg/mL時(shí)，其抗氧化活性蜂膠醇提物>BHT>石油醚提取物>己烷醚提取物>乙醚提取物：在5mg/mL時(shí)，石油醚提取物的抗氧化活性為82.2％，從圖1中可以直接讀出清除率為50％時(shí)的濃度IC50約為30g/mL。從圖2可以看出，在0.5mg/mL和0.01mg/mL時(shí)，抗氧化活性蜂膠醇提物>BHT>石油醚提取物>己烷醚提取物>乙醚提取物，三種蜂膠揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除率有較大的差別，表明為具有中強(qiáng)等抗氧化活性，清除率為10.87％～87.91％。

4 討論

采用了石油醚、乙醚、己烷作為溶劑，通過(guò)超聲波法提取蜂膠揮發(fā)性成分，并用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化石油醚提取揮發(fā)油工藝，得出最佳提取工藝參數(shù)。但沒(méi)有在充分利用試驗(yàn)結(jié)果信息的基礎(chǔ)上，用回歸分析的方法，對(duì)均值和極差分析對(duì)其進(jìn)行和修正，使工藝參數(shù)更符合實(shí)際情況。

本文對(duì)三種溶劑提取的揮發(fā)油和精制蜂膠和BHT的抗氧化效果作了比較研究，發(fā)現(xiàn)三種揮發(fā)油均有一定的抗氧化效果。為蜂膠產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，將來(lái)還需要對(duì)其抗氧化機(jī)理及成分進(jìn)行分析。

[1] 付中民,鄭艷萍,楊文超,繆曉青.蜂膠提取工藝的研究[J].中國(guó)蜂業(yè),2008,59(10):26

[2] 王亞群,任永新.蜂膠的化學(xué)成分及其保健作用[J].食品與藥品,2006,8(12):75-76.

[3] Rudzkie,Grzywaz.Dermatitis from propoLis[J].contact Dermatitis,1983,9:40-45

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[5] 趙強(qiáng).蜂膠中揮發(fā)油有效成分的研究[D].南昌:南昌大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007.

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繆曉青，福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院院長(zhǎng)，教授/博導(dǎo)。